El blindaje de la actina por el retículo endoplásmico afecta el posicionamiento nuclear

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 2763 (2022) Citar este artículo

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La posición nuclear es fundamental para la polarización celular y su alteración está asociada con diversas patologías. El núcleo se aleja del borde de ataque de las células migratorias a través de su conexión con cables de actina dorsales en movimiento y la ausencia de conexiones con fibras de tensión ventrales inmóviles. No está claro cómo se establecen estas conexiones asimétricas entre el núcleo y el citoesqueleto. Aquí, utilizando un ensayo de herida in vitro, encontramos que la remodelación del retículo endoplásmico (RE) afecta el posicionamiento nuclear a través de la formación de una barrera que protege las fibras de tensión ventrales inmóviles. La remodelación del RE y la acumulación perinuclear del RE está mediada por la proteína formadora del RE Climp-63. Además, el reclutamiento ectópico del RE para tensionar las fibras restaura el posicionamiento nuclear en ausencia de Climp-63. Nuestros hallazgos sugieren que el RE media conexiones asimétricas núcleo-citoesqueleto para posicionar el núcleo.

El núcleo celular a menudo se representa en los libros de texto como flotando en el centro de la célula. Sin embargo, la posición del núcleo está altamente regulada y está asociada con la función celular1. La posición del núcleo cambia a menudo durante diferentes procesos biológicos, como la división celular, la diferenciación celular y la migración celular2,3,4. Cada vez hay más pruebas que sugieren que el posicionamiento de los núcleos está asociado con funciones celulares especializadas, y que una mala regulación del posicionamiento nuclear podría provocar disfunción celular y enfermedades, como miopatías centronucleares, progeria y lisencefalia5,6.

El posicionamiento nuclear a menudo requiere conexiones del núcleo con el citoesqueleto7. Estas conexiones núcleo-citoesqueleto están determinadas principalmente por el complejo ENLACE de nucleoesqueleto y citoesqueleto (LINC) en la envoltura nuclear8. El complejo LINC está compuesto por proteínas de la envoltura nuclear externa (ONM) de la familia Nesprin que interactúan con el citoesqueleto, y proteínas de la envoltura nuclear interna (INM) de la familia SUN, que interactúan con la lámina nuclear. Los dominios KASH de las proteínas Nesprin interactúan con los dominios SUN de las proteínas SUN en la luz de la envoltura nuclear9. Se ha descubierto que múltiples proteínas están involucradas en las conexiones núcleo-citoesqueleto mediante el complejo LINC; sin embargo, se desconoce cómo estas conexiones núcleo-citoesqueleto se activan y desactivan durante el posicionamiento nuclear10,11.

La posición del núcleo durante la migración celular es de suma importancia, ya que puede afectar la velocidad de la migración10,12, la selección del camino de menor resistencia13 y la ruptura de las barreras endoteliales14. El ensayo de cicatrización de heridas es un enfoque clásico para estudiar la migración celular en el que las células del borde de la herida se estimulan con factor sérico de ácido lisofosfatídico (LPA) para alejar su núcleo del borde de ataque12,15. El movimiento hacia atrás del núcleo es impulsado por cables dorsales de actina en movimiento acoplados al núcleo mediante matrices lineales de la proteína de la envoltura nuclear Nesprin-2G, conocidas como líneas nucleares transmembrana asociadas a actina (TAN)12,15. Durante el movimiento nuclear, el núcleo no se conecta a las fibras de tensión ventrales inmóviles, aunque Nesprin-2G se distribuye simétricamente por toda la envoltura nuclear12. Por tanto, el núcleo está conectado asimétricamente a los cables de actina dorsales pero no a las fibras de tensión ventrales durante el movimiento nuclear. Se desconoce cómo se establecen estas conexiones asimétricas núcleo-citoesqueleto.

El retículo endoplasmático (RE) es contiguo a la envoltura nuclear y es el nodo central en la red del interactoma de orgánulos16. El RE se propaga por todo el citoplasma como una red compleja interconectada de estructuras planas (láminas), redes reticulares (túbulos) y una densa red de túbulos (matrices del RE). La morfología y distribución del complejo ER está regulada por proteínas formadoras de ER17,18,19. Por lo tanto, intentamos investigar si la morfología y distribución del ER podrían regular el posicionamiento nuclear. Aquí revelamos que la sala de emergencias participa en el establecimiento de conexiones asimétricas núcleo-citoesqueleto necesarias para el posicionamiento nuclear.

No se sabe cómo se organiza la sala de emergencias durante el posicionamiento nuclear. Por lo tanto, investigamos la morfología y distribución del ER durante el posicionamiento nuclear en fibroblastos NIH3T3 migratorios. Utilizamos el ensayo de cicatrización de heridas, donde el LPA induce el posicionamiento nuclear hacia atrás en las células del borde de la herida. Para comprender cómo se organiza el RE durante el posicionamiento nuclear, analizamos el RE en células no LPA (no polarizadas) y células estimuladas con LPA (polarizadas) en el borde de la herida mediante el uso de microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado (FIB-SEM) (Fig. .1a–d). El RE puede formar láminas, túbulos o matrices mediadas por proteínas formadoras del RE17,18,19. El análisis del volumen celular FIB-SEM reveló una diferencia sustancial en la morfología y distribución del ER entre las células no estimuladas con LPA y las estimuladas con LPA. La célula estimulada con LPA presentó un aumento en las láminas del ER (rojo oscuro), a expensas de una reducción en los túbulos del ER (rojo claro), en comparación con la célula no estimulada con LPA (Fig. 1a-d). Además, la célula estimulada con LPA exhibió una acumulación de ER perinuclear, en comparación con la célula no estimulada con LPA (Fig. 1b, d; Fig. complementaria 1a, b). Las condiciones de adquisición utilizadas para FIB-SEM se seleccionaron para dar como resultado un paso de 8 nm en la posición Z, lo que nos permitió segmentar y representar en tres dimensiones (3D) las estructuras ER notablemente complejas y contorneadas. El análisis de la morfología del ER en 3D confirmó que el ER perinuclear está organizado principalmente en láminas en las células estimuladas con LPA, mientras que las células no estimuladas con LPA presentaron más túbulos ER (Figura complementaria 1a). Estos resultados sugieren que durante el posicionamiento nuclear, el ER se acumula en la región perinuclear y sufre una transición de túbulos a láminas.

una imagen representativa de FIB-SEM de una célula U2OS no polarizada y no estimulada por LPA en el borde de la herida. Una pila de 998 imágenes SEM de una celda de vanguardia. b Imágenes representativas de regiones perinucleares (recuadros amarillos) y periféricas (recuadros verdes). El RE está resaltado en rojo, el rojo claro representa los túbulos (<1 µm), el rojo oscuro representa las láminas (>1 µm). Las medidas representan la profundidad de la sección. c como en a, pero una célula estimulada y polarizada por LPA. Una pila de 1798 imágenes SEM de una celda de vanguardia. d como en b, pero una célula polarizada y estimulada por LPA. e Imágenes representativas de epifluorescencia de campo amplio de fibroblastos NIH3T3 del borde de la herida. Las células se inmunotineron para detectar contactos célula-célula (púrpura; β-catenina), centrosoma (blanco; pericentrina) y ADN (DAPI, azul). f Posiciones nucleares relativas al centroide celular de las células representadas en e. Se calculó la significancia (prueba t no apareada de dos colas) entre la condición experimental y el ARNip codificado con LPA. ****p < 0,0001 (Scramble sin LPA, Nesprin-2G, Climp-63 #1, Climp-63 #2, Triple KD); *p < 0,05. El cuadro muestra el primer cuartil, la mediana y el tercer cuartil, y los bigotes muestran un percentil del 10 al 90 %. Los experimentos se repitieron ≥3, excepto (a – d). Barras de escala: a, b, c, d 1 µm; mi 40 µm.

Para probar si la morfología del ER está involucrada en el posicionamiento nuclear hacia atrás, manipulamos varias proteínas que modulan la relación láminas-túbulos del ER y la distribución del ER, conocidas como proteínas que dan forma al ER20. Agotamos las proteínas relacionadas con las láminas del ER (Climp-63, p180, Kinectin-1, Myosin-1C) y una proteína involucrada en el mantenimiento de los túbulos del ER (Reticulon-4) (Fig. 1e, f; Fig. complementaria 1c, d) 17,18,19,21,22,23,24. El agotamiento de Climp-63 (proteína 63 de la membrana de unión al citoesqueleto) bloqueó el posicionamiento nuclear hacia atrás en los fibroblastos del borde de la herida tras la estimulación con LPA en el mismo grado que en las células agotadas en Nesprin-2G (Fig. 1f). El agotamiento de otras proteínas implicadas en la morfología de la hoja del RE (p180, Kinectin-1 y Myosin-1C) también bloqueó el posicionamiento nuclear, pero sólo en un 40% en comparación con las células agotadas en Nesprin-2G. El agotamiento de Reticulon-4 (asociado con la formación de túbulos del RE) no afectó el posicionamiento nuclear hacia atrás. Para estudiar más a fondo cómo los cambios en la morfología y distribución del ER bloquearon el movimiento nuclear, realizamos microscopía de lapso de tiempo durante el movimiento nuclear estimulado por LPA en células scramble y Climp-63 siRNA (Figura complementaria 1e). La cuantificación de la persistencia y la persistencia direccional del movimiento nuclear reveló que el agotamiento de Climp-63 perjudicó el movimiento nuclear hacia atrás, en comparación con las células de vanguardia de ARNip codificadas (Figura complementaria 1f-h). Por lo tanto, la proteína Climp-63 que da forma al ER es necesaria para el posicionamiento nuclear.

Para investigar si Climp-63 tiene un papel en la acumulación perinuclear de ER durante el posicionamiento nuclear, analizamos el ER en fibroblastos estimulados con LPA y sin LPA del borde de la herida. En las células no estimuladas con LPA, el agotamiento de Climp-63 no interfirió con la acumulación perinuclear de ER (Fig. 2a, b). Sin embargo, tras la estimulación con LPA, observamos un aumento en la acumulación perinuclear de ER que dependía de Climp-63 (Fig. 2a, b).

a Imágenes representativas de Airyscan confocales de escaneo de puntos de fibroblastos que expresan GFP-KDEL en el borde de la herida tratados con ARNip o Climp-63, estimulados y no estimulados con LPA. La región perinuclear de interés (ROI) está resaltada (cuadro amarillo) y representada como escala de grises (arriba) y como mapa de calor (abajo). b Cuantificación de la acumulación de células perinucleares en el RE representada en a. tratados con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde). Se calculó la significancia (prueba t no pareada de dos colas) entre las condiciones experimentales y la mezcla con LPA (segunda condición). c Quimografía confocal de disco giratorio de fluorescencia del movimiento nuclear y acumulación perinuclear de ER en células que expresan GFP-KDEL en el borde de la herida tratadas con ARNip scramble (arriba) o Climp-63 (abajo) tras estimulación con LPA. Las imágenes corresponden a la proyección de intensidad máxima de las pilas z desde el lado ventral al dorsal de la celda. La intensidad de la señal se representa como un mapa de calor térmico. d Cuantificación de la acumulación perinuclear de ER en células estimuladas con LPA tratadas con ARNip scramble (gris, n = 22 células de 4 experimentos independientes) o Climp-63 (verde, n = 21 células de 4 experimentos independientes), a lo largo del tiempo, representado en c. Se calculó la significancia (prueba t no apareada de dos colas) entre los ARNip codificados y Climp-63 para cada punto temporal. e Cuantificación de la acumulación perinuclear de ER (línea gris) y el movimiento nuclear a lo largo del tiempo (línea azul), en células estimuladas con LPA en lucha (izquierda, n = 61 células de 4 experimentos independientes) o Climp-63 (derecha, n = 37 células de 4 experimentos independientes) siRNA. La acumulación perinuclear de ER son los mismos datos que en d. Barras de escala: a, c 10 µm. Barras de error, SEM. **p < 0,01, *p < 0,05.

A continuación, se utilizó microscopía de lapso de tiempo de células de ARNip codificadas del borde de la herida transfectadas de manera estable con GFP-KDEL, que marca el RE, para investigar la relación entre el posicionamiento nuclear y la compactación perinuclear del RE tras la estimulación con LPA. En células de ARNip codificadas, la estimulación con LPA condujo a Acumulación de ER en la región perinuclear que se correlaciona con el movimiento nuclear hacia atrás (Fig. 2c-e (izquierda); Película complementaria 1). En ausencia de Climp-63, observamos una acumulación menor de ER perinuclear tras la estimulación con LPA, mientras que no se observó movimiento nuclear de recompensa (Fig. 2c-e (derecha), Película complementaria 2). Las células de ARNip codificadas aumentaron en un 25% en el RE perinuclear, 120 minutos después de la estimulación con LPA en comparación con 5 minutos. Por otro lado, las células de eliminación de ARNip (KD) de Climp-63 solo aumentaron un 9% (120 min frente a 5 min) (Fig. 2d). En ausencia de LPA, las células tratadas con ARNip Scramble o Climp-63 no exhibieron compactación perinuclear del RE ni movimiento nuclear a lo largo del tiempo (Figuras complementarias 2a, b). Estos resultados indican que la acumulación perinuclear de ER ocurre de manera dependiente de Climp-63 durante el posicionamiento nuclear.

Climp-63 es una proteína transmembrana integral del RE de extensión única con un dominio luminal y citoplasmático25,26 (Fig. 3a). La homodimerización de su dominio luminal está implicada en la regulación del ancho luminal del RE y convierte a Climp-63 en un espaciador luminal del RE19,21. Por otro lado, su dominio citoplasmático se une a los microtúbulos de forma dependiente de la fosforilación, lo que contribuye a la distribución de la lámina del RE19,21,27. Climp-63 se asocia principalmente con el mantenimiento de la lámina perinuclear del ER21. Para identificar los dominios de Climp-63 involucrados en el posicionamiento nuclear y la acumulación perinuclear de ER, microinyectamos una serie de fragmentos de Climp-63 en fibroblastos empobrecidos en Climp-63 del borde de la herida (Fig. 3a). La expresión del dominio luminal, pero no del dominio citoplasmático, en células agotadas en Climp-63 fue suficiente para restaurar el posicionamiento nuclear y la acumulación perinuclear de ER (Fig. 3b-d). La expresión de construcciones Climp-63 de longitud completa con mutaciones en el dominio de unión de microtúbulos que previenen o aumentan la interacción con los microtúbulos fue suficiente para restaurar no solo el posicionamiento nuclear, sino también la acumulación perinuclear del RE (Fig. 3b-d)26,28. Además, el agotamiento de Climp-63 no afecta la red de microtúbulos en las células del borde de la herida (Figura complementaria 2c). Estos resultados demuestran que el dominio luminal de Climp-63 es suficiente para rescatar el posicionamiento nuclear y la acumulación perinuclear del RE, independientemente de la interacción de Climp-63 con los microtúbulos. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la acumulación perinuclear del RE es necesaria para el posicionamiento nuclear y que los cambios en la morfología del RE también pueden estar involucrados en el proceso.

a Representación esquemática de los plásmidos sintetizados Climp-63. Climp-63 es la proteína de longitud completa. El mutante citoplasmático (Cyto) carece del dominio luminal. El mutante luminal (Lum) carece del dominio citoplasmático. El mutante (-) MT no se une a los microtúbulos. El mutante (+) MT está constitutivamente unido a microtúbulos. Los asteriscos representan las mutaciones resistentes al ARNip. b Posiciones nucleares promedio en relación con el centroide celular de las células tratadas con ARNip o Climp-63 y microinyectadas con los plásmidos indicados. Se calculó la significancia (prueba t no apareada de dos colas) entre las condiciones experimentales y las células de ARNip Climp-63 (segunda condición). ****p < 0,0001 (Scramble solo, Climp-63); El cuadro muestra el primer cuartil, la mediana y el tercer cuartil, y los bigotes muestran el percentil del 10 al 90 %. c Cuantificación del porcentaje de células con acumulación de RE perinuclear. La significancia (prueba t no apareada de dos colas) se calculó entre las condiciones experimentales y las células que expresan Climp-63 (tercera condición). Barras de error, SEM. d Imágenes confocales representativas de escaneo de puntos de células del borde de la herida tratadas con ARNip Climp-63 y microinyectadas con los plásmidos que se muestran en a. Los ROI perinucleares están resaltados (cuadro amarillo) y representados como escala de grises (arriba) y como mapa de calor (abajo). Los experimentos se repitieron ≥3. Barras de escala: d 10 µm. **p < 0,01, *p < 0,05.

El posicionamiento nuclear en los fibroblastos del borde de la herida es impulsado por el flujo retrógrado de actina, que aleja los cables dorsales de actina del borde anterior. Cuando estos cables dorsales llegan al lado dorsal del núcleo, se anclan a Nesprin-2G en la envoltura nuclear y desencadenan la formación de matrices lineales de Nesprin-2G, conocidas como líneas TAN12,29,30,31. Por tanto, el movimiento de los cables dorsales de actina anclados a las líneas TAN impulsa el movimiento nuclear. Analizamos el papel de Climp-63 en el flujo retrógrado de actina, las líneas TAN y la organización de actina. Para medir el flujo retrógrado de actina, utilizamos células transfectadas de manera estable que expresan LifeAct-mCherry y descubrimos que el agotamiento de Climp-63 no interfirió con la direccionalidad y la velocidad del flujo retrógrado de actina, en comparación con las células de ARNip codificadas (Figuras complementarias 3a-c). La expresión del dominio luminal Climp-63 en células de ARNip de Climp-63 (que rescata la acumulación perinuclear del RE y el posicionamiento nuclear) tampoco afectó la velocidad del flujo retrógrado de actina, en comparación con las células de ARNip codificadas (Figura complementaria 3c). Para investigar el ensamblaje de líneas TAN, microinyectamos células del borde de la herida tratadas con ARNip y Climp-63 con EGFP-mini-N2G, una sonda que se acumula en las líneas TAN y descubrimos que el agotamiento de Climp-63 no afecta el número de líneas TAN por núcleo. , ni el porcentaje de núcleos con líneas TAN (Fig. 4a-c). Además, el análisis de la organización del citoesqueleto de actina reveló que Climp-63 KD no afectó la arquitectura de la red de actina en la región perinuclear. No observamos ningún cambio en la morfología y el número de fibras de tensión ventrales o cables de actina dorsales por núcleo, entre las células tratadas con ARNip y Climp-63 (Fig. 4d-f). Por lo tanto, estos resultados indican que Climp-63 y la acumulación perinuclear de ER no están involucrados en la participación del flujo retrógrado de actina y en la conexión de la actina dorsal con las líneas TAN de la envoltura nuclear en el lado dorsal del núcleo.

a Imágenes de epifluorescencia representativas de fibroblastos tratados con ARNip o Climp-63 que expresan GFP-mini-N2G y teñidos con faloidina (actina F). Las flechas muestran la colocalización de Nesprin-2G con cables de actina dorsales. b Cuantificación del número de líneas TAN por núcleo en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en a. c Cuantificación del porcentaje de núcleos con líneas TAN en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en a. d Imágenes de epifluorescencia representativas de células del borde de la herida después de la estimulación con LPA. Las células se tiñeron de la siguiente manera: actina F (faloidina, rojo), ADN (DAPI, azul). Región nuclear resaltada con un cuadro discontinuo amarillo. Izquierda: plano focal ventral. Derecha: plano focal dorsal. e Cuantificación del número de fibras de estrés ventrales nucleares por núcleo en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en d. f Cuantificación del número de cables de actina dorsales nucleares por núcleo en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en d. g Quimografía de fluorescencia del movimiento nuclear y la acumulación ventral de ER en células que expresan GFP-KDEL del borde de la herida tratadas con ARNip scramble (arriba) o Climp-63 (abajo) tras estimulación con LPA. h Cuantificación de la acumulación de ER ventral durante la estimulación con LPA en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde), representada en g. Se calculó la significancia (prueba t no apareada de dos colas) entre los ARNip codificados y Climp-63 para cada punto temporal. i Cuantificación de la acumulación perinuclear de ER (línea gris) y el movimiento nuclear a lo largo del tiempo (línea azul), durante la estimulación con LPA de las células representadas en g. La línea gris corresponde a la línea gris en h. j Quimógrafo de fluorescencia del movimiento nuclear y acumulación del RE dorsal en células que expresan GFP-KDEL del borde de la herida tratadas con ARNip scramble (arriba) o Climp-63 (abajo) tras estimulación con LPA. k Cuantificación de la acumulación de ER dorsal durante la estimulación con LPA en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde), representadas en j. Los experimentos se repitieron 3 veces. Barras de escala: a, d 5 µm; g, j 20 µm. Barras de error, SEM. **p < 0,01, *p < 0,05.

A continuación, investigamos la acumulación de ER en los lados dorsal y ventral del núcleo durante el movimiento nuclear. Cuantificamos la acumulación perinuclear del marcador ER KDEL durante el posicionamiento nuclear tras la estimulación con LPA en el lado dorsal y ventral del núcleo en células tratadas con ARNip Climp-63 (Fig. 4g-k). En el lado ventral del núcleo, observamos un aumento significativo en la acumulación de ER durante el movimiento nuclear en células de ARNip codificadas, mientras que no se observó ningún aumento en las células de ARNip Climp-63 (Fig. 4g-h). Además, el movimiento nuclear se correlaciona con la acumulación de ER ventral (Fig. 4i). Por el contrario, no observamos diferencias en la acumulación de ER dorsal entre las células tratadas con ARNip y Climp-63 durante el movimiento nuclear (Fig. 4j, k). El papel diferente de Climp-63 en la acumulación de ER en el lado ventral versus dorsal del núcleo no se debió a la localización de Climp-63, ya que GFP-Climp-63 microinyectado en células empobrecidas de Climp-63 se distribuyó igualmente en el ventral y lado dorsal del núcleo (Figuras complementarias 4a, b).

Las técnicas de microcopia de súper resolución, Airyscan y microscopía de iluminación de estructura (SIM) validaron aún más la reducción de ER en la región ventral del núcleo en células Climp-63 KD, en comparación con las células KO codificadas (Figuras complementarias 4c-e). Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de secciones sagitales de células del borde de la herida reveló una reducción del ancho y el área luminal del RE ventral tras el agotamiento de Climp-63, mientras que el ancho luminal de la envoltura nuclear no se vio afectado (Figuras complementarias 4f-j). La reducción del ancho de la luz del RE tras el agotamiento de Climp-63 fue similar a la reducción previamente informada de la luz del RE no ventral en células agotadas de Climp-6319,21. Estos resultados indican que el ER se acumula tanto en las regiones ventral como dorsal durante el posicionamiento nuclear. La acumulación de ER en el lado ventral depende de Climp-63. Por otro lado, la acumulación de ER en el lado dorsal es independiente de Climp-63 y no interfiere con el anclaje del núcleo a los cables de actina dorsales que impulsan el movimiento nuclear.

Durante el posicionamiento nuclear, el núcleo establece conexiones núcleo-citoesqueleto asimétricas uniéndose a la actina dorsal en movimiento, pero no a las fibras de tensión ventrales inmóviles12. Mientras que la actina dorsal participa en el flujo retrógrado de actina, las fibras de tensión ventrales se conectan a adherencias focales y, por lo tanto, permanecen inmóviles. Aún no está claro por qué las fibras de tensión ventrales no se conectan al núcleo, a pesar de que Nesprin-2G y otras proteínas del complejo LINC están distribuidas simétricamente por toda la envoltura nuclear10,12.

Para comprender si la acumulación de ER ventral durante el posicionamiento nuclear se asoció con las fibras de estrés ventral, realizamos SIM de lapso de tiempo de actina y ER en el lado ventral del núcleo en células del borde de la herida durante el posicionamiento nuclear. Observamos que el RE ventral envuelve y encierra las fibras de tensión ventrales (Fig. 5a), de acuerdo con nuestra observación anterior de que durante el posicionamiento nuclear, el RE se acumula en la región perinuclear. El RE ventral exhibió desplazamientos menores a lo largo de estas fibras de estrés ventrales durante el movimiento nuclear, lo que sugiere una interacción estrecha y dinámica entre el RE y las fibras de estrés ventrales. Las imágenes de apilamiento en Z revelaron dos tipos principales de interacciones: el RE envolvió actina a lo largo de la fibra de tensión o se parecía a ganchos de RE alrededor de las fibras (Figura complementaria 5a, Película complementaria 3-4). En las células agotadas para Climp-63, observamos una reducción en la cantidad de células con fibras de estrés ventrales envueltas por ER durante el posicionamiento nuclear (Fig. 5a, b). Para cuantificar la envoltura de actina por ER, medimos el área de colocalización de ER (GFP-KDEL) con fibras de estrés ventrales (LifeAct-mCherry) usando SIM. El área de ER y colocalización de actina también se redujo en las células Climp-63 KD en comparación con las células de ARNip codificadas (Fig. 5c, d). El área de actina ventral no fue diferente entre las células de ARNip scramble y Climp-63 (Fig. 5c, e). Las imágenes de súper resolución de la región nuclear dorsal no mostraron diferencias en el área del RE dorsal y la cobertura de actina por el RE entre las células de ARNip Scramble y Climp-63 (Figuras complementarias 5b-d). Esta observación es consistente con nuestras observaciones de que Climp-63 no participa en la acumulación de ER dorsal ni en el establecimiento de líneas TAN (Fig. 4). Además, el agotamiento de Climp-63 no afectó la distribución de Nesprin-2G en la envoltura nuclear ni la forma nuclear (Figuras complementarias 6a-e). Además, la cantidad de ER no se vio afectada por el agotamiento de Climp-63, como se informó anteriormente (Figura complementaria 6f)21. Con base en estos resultados, planteamos la hipótesis de que la envoltura de las fibras de tensión de actina por parte del RE podría actuar como un escudo que impide el anclaje del núcleo a las fibras de tensión ventrales inmóviles. Por lo tanto, en ausencia de Climp-63, cuando no se produce la envoltura del ER de las fibras de tensión de actina, el núcleo quedaría anclado a las fibras de tensión ventrales inmóviles y no podría moverse.

a Imágenes representativas de microscopía de iluminación de estructura (SIM) de un video de lapso de tiempo durante el movimiento nuclear de fibroblastos GFP-KDEL y LifeAct-mCherry del borde de la herida tratados con ARNip scramble y Climp-63. Las flechas en el ROI resaltado muestran el blindaje de actina ventral por parte del ER durante el movimiento nuclear. b Cuantificación del porcentaje de células con protección ER de fibras de estrés ventrales de actina en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en a. c Imágenes representativas de microscopía de iluminación de estructura (SIM) de células GFP-KDEL y LifeAct-mCherry del borde de la herida tratadas con ARNip scramble (gris) y Climp-63 (verde). Las regiones de interés están resaltadas (cuadro amarillo) y representadas como aumentos x3 (derecha). d Cuantificación del área de ER y colocalización de actina por um2 de actina por núcleo en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en c. e Cuantificación del área de actina ventral nuclear en células tratadas con ARNip scramble (gris) o Climp-63 (verde) como en c. La significancia (prueba t no apareada de dos colas) se calculó entre el ARNip de scramble y Climp-63. Los experimentos se repitieron ≥3. Barras de escala: a, c 5 µm. Barras de error, SEM. *p < 0,05.

Para probar si es necesaria la envoltura de actina por parte del ER para el posicionamiento nuclear, ideamos dos estrategias para reclutar ER en fibras de actina en células Climp-63 KD. Anteriormente se demostró que GFP-mini-N2G que carece de la región luminal (GFP-m-N2GΔL) no interactúa con el complejo LINC y, por lo tanto, se distribuye por todo el RE. GFP-m-N2GΔL puede unirse a la actina a través del dominio CH N-terminal12. Por tanto, GFP-m-N2GΔL puede reclutar ER para el citoesqueleto de actina. Descubrimos que la expresión mediante microinyección de GFP-m-N2GΔL en células del borde de la herida Climp-63 KD restauró el área ventral del RE y las fibras de estrés de actina que envuelven el RE al mismo nivel que las células microinyectadas con Climp-63 y las células tratadas con ARNip codificadas. (Figuras 6a-c). En el lado dorsal, no se observaron diferencias en el área ER, envoltura de actina dorsal por la formación de líneas ER y TAN tras la expresión de GFP-mN2GΔL en células de ARNip Climp-63, en comparación con las células de ARNip Scramble (Figuras complementarias 5b-d, complementarias Figura 6g, h). Es importante destacar que la expresión de GFP-m-N2GΔL también rescató el posicionamiento nuclear al mismo nivel que las células microinyectadas con Climp-63 y las células tratadas con ARNip codificadas (Fig. 6d, e).

a Imágenes confocales representativas de Airyscan de células del borde de la herida que expresan de manera estable LifeAct-mCherry y microinyectadas con HaloTag-Sec61 junto con GFP-KDEL, GFP-Climp-63 o GFP-mN2GΔL, GFP-INF2-CAAX y GFP-INF2-nonCAAX. El ROI resaltado (cuadro amarillo) representa los recuadros que se presentan a continuación. b Cuantificación del área del RE ventral en células tratadas como en a. Barras de error, SEM. Se calculó la significancia (prueba t no pareada de dos colas) entre las condiciones experimentales y la primera condición. c Cuantificación del porcentaje del área del cable de actina cubierta por ER en células tratadas como en a. Barras de error, SEM. La significancia ((prueba t no apareada de dos colas) se calculó entre las condiciones experimentales y la primera condición. d Imágenes representativas de epifluorescencia de células del borde de la herida tratadas con ARNip Climp-63 microinyectadas con GFP-KDEL, GFP-mN2GΔL GFP-INF2-CAAX o GFP-INF2-nonCAAX. Las células se tiñeron de la siguiente manera: actina (faloidina, rojo), GFP (verde), ADN (DAPI, azul). e Posiciones nucleares relativas al centroide celular en las células tratadas como en d. El cuadro muestra el primer cuartil , la mediana y el tercer cuartil, y los bigotes muestran un percentil del 10 al 90 %. Se calculó la significancia (prueba t no apareada de dos colas) entre la condición experimental y el ARNip codificado. ****p < 0,0001 (ARNip Climp-63 solo, GFP -KDEL), **p < 0,01, *p < 0,05. Los experimentos se repitieron ≥ 3. Barra de escala: a 5 µm, d 10 µm.

La segunda estrategia que utilizamos para reclutar ER para las fibras de actina involucró la forma 2 invertida (INF2). INF2 tiene dos isoformas de empalme, CAAX que se localiza en el RE y no CAAX que se localiza en adherencias focales y citoplasma32,33. Resultados anteriores han demostrado que la expresión de GFP-INF2-CAAX, pero no de INF2 sin el dominio CAAX (GFP-INF2-nonCAAX), induce el enriquecimiento de actina alrededor del ER34. De acuerdo con estos resultados anteriores, encontramos que la expresión de GFP-INF2-CAAX en células de ARNip de Climp-63 restauró el área ventral del RE, las fibras de estrés de actina que envuelven el RE y el posicionamiento nuclear al mismo nivel que las células microinyectadas con Climp-63. y codificar las células tratadas con ARNip (Fig. 6a-e). Por otro lado, la sobreexpresión de INF2 sin el dominio CAAX (GFP-INF2-noCAAX) en células de ARNip Climp-63 no rescató el posicionamiento nuclear y restauró parcialmente el área ventral del RE y las fibras de estrés de actina envueltas por el RE (Fig. 6a -mi). En el lado dorsal, no se observaron diferencias en el área ER, envoltura de actina dorsal por la formación de líneas ER y TAN tras la expresión de isoformas INF2 en células de ARNip Climp-63, en comparación con las células de ARNip Scramble (Figuras complementarias 5b-d, Figuras complementarias .6g, h). Por lo tanto, estos resultados indican que el reclutamiento de ER en actina ventral es suficiente para rescatar el posicionamiento nuclear en ausencia de Climp-63, probablemente a través de la inhibición de las conexiones ventrales entre el núcleo y el citoesqueleto.

La posición del núcleo es un sello distintivo de la polarización celular, y la mayoría de los mecanismos de posicionamiento nuclear se basan en interacciones núcleo-citoesqueleto5,35,36,37,38,39,40. Aquí describimos cómo el ER puede generar conexiones núcleo-citoesqueleto asimétricas necesarias para el movimiento nuclear.

Descubrimos que Climp-63 es necesario para el posicionamiento nuclear y la acumulación de ER ventral, pero no dorsal. El reclutamiento de ER para actina restaura el movimiento nuclear en células agotadas en Climp-63. Nuestros resultados sugieren que en ausencia de Climp-63, las fibras de tensión ventrales inmóviles no están envueltas por ER y, por lo tanto, pueden interactuar con el núcleo mediante un mecanismo no identificado, evitando así el movimiento nuclear de los cables de actina dorsales. Por lo tanto, el RE puede actuar como un escudo para las interacciones núcleo-citoesqueleto ventral, permitiendo el movimiento nuclear impulsado por cables de actina dorsales conectados a la envoltura nuclear (Fig. 7).

Diagrama de vista sagital de dos células del borde de la herida, con el borde anterior en el lado derecho, sobre un sustrato (gris claro). Célula superior: tras la estimulación (control) de LPA, el núcleo se aleja del borde de ataque, mientras que el RE se acumula en la región perinuclear. Como resultado, el RE ventral protege las fibras de tensión ventrales inmóviles y el núcleo se aleja del borde de ataque conectado a los cables de actina dorsales. Celda inferior: en ausencia de Climp-63, hay una reducción de la acumulación perinuclear de ER que conduce a una reducción de las fibras de estrés ventrales que protegen a ER. Por lo tanto, el núcleo puede interactuar con fibras de tensión ventrales inmóviles, lo que resulta en un tira y afloja entre los cables de actina dorsales que intentan mover el núcleo hacia atrás y las fibras de tensión ventrales que anclan el núcleo.

El conocimiento sobre el papel de las proteínas moldeadoras de ER en la morfología de ER ha ido creciendo durante la última década. El papel de Kinectin-1 y p180 en la distribución del ER aún es controvertido y podría depender del tipo de célula, pero cabe mencionar que se describió que la KD de ambas proteínas aumenta el ER perinuclear41,42. Por otro lado, el papel de Climp-63 como regulador del ancho de las láminas del RE y de la acumulación perinuclear es más consensuado, y tanto el dominio luminal como el citoplasmático parecen regularlo19,21,43. También se ha informado que Climp-63 KD disminuye el RE perinuclear, lo que corrobora nuestros resultados21. Nuestro trabajo sugiere que el dominio luminal de Climp-63 regula la morfología y distribución del RE y el movimiento nuclear de forma independiente de los microtúbulos.

El movimiento nuclear en los fibroblastos migratorios es impulsado por cables de actina dorsales conectados al lado dorsal del núcleo mediante nesprin-2G en líneas TAN12,15. Nuestros resultados muestran que Climp-63 no participa en la regulación del RE dorsal. Los cables dorsales de actina y su conexión con el núcleo a través de líneas TAN, la fuerza impulsora del movimiento nuclear en los fibroblastos migratorios, tampoco dependen de la morfología de Climp-63 y ER. Nuestros datos sugieren que las conexiones actina-citoesqueleto mediadas por líneas TAN en el lado dorsal del núcleo son independientes de la morfología del RE y de cualquier posible interacción entre actina y RE. En cambio, nuestros resultados sugieren que el papel del ER en el movimiento nuclear implica el blindaje de las fibras de tensión ventrales inmóviles, evitando así la conexión entre el núcleo y las fibras de tensión ventrales. Proponemos un mecanismo para inhibir las conexiones núcleo-citoesqueleto que involucran el blindaje ER del citoesqueleto de actina. Este mecanismo genera conexiones núcleo-citoesqueleto asimétricas necesarias para el movimiento nuclear en ausencia de distribución asimétrica del complejo LINC44. Nuestra hipótesis es que este mecanismo también puede estar implicado en el cambio entre núcleos de anclaje y móviles en las células1,8, y en la mecanotransducción45.

El RE contacta con múltiples orgánulos y la membrana plasmática, y estos contactos están involucrados en la distribución de lípidos, la regulación del calcio y la dinámica de los orgánulos46,47,48. Aquí proponemos que el RE también puede comportarse como un escudo para evitar interacciones entre la actina y el núcleo. Presumimos la participación de esta función del ER en otras interacciones entre el citoesqueleto y los orgánulos, y también en los contactos del ER con los orgánulos.

Se cultivaron fibroblastos NIH3T3 (AATC) en medio de crecimiento (DMEM sin piruvato de sodio; 41965-039, Life Technologies), suplementado con suero de ternera bovino al 10 % (Corning, 35-053-CM), HEPES 10 mM (15630056, Life Technologies) y penicilina/estreptomicina a 500 unidades/ml (15140-122, Life Technologies). Se cultivaron células U2OS (AATC) en medio de crecimiento (DMEM con piruvato de sodio; 41966-029, Life Technologies), suplementado con suero bovino fetal al 10 % (CVFSVF00-01, Eurobio) y penicilina/estreptomicina a 500 unidades/ml. Para ambos tipos de células, el medio sin suero tiene la misma composición que el medio de crecimiento, excepto el suero bovino de ternera o el suero fetal bovino. Se transfectaron pequeños ARN de interferencia (siRNA) como se describió anteriormente usando Lipofectamine RNAiMAX (13778-150, Invitrogen). El ARNip de Nesprin-2G se fabrica a medida en Genecust Europe, como se describió anteriormente10. The Scramble (4390843), Climp-63 #1 (s103547), Climp-63 #2 (s103548), p180 (s96290), Kinectin-1 (s69027), Myosin-1C (s70302) y Reticulon-4 (86843) Los ARNip son ARNip Silencer Select comerciales de ThermoFisher Scientific. Las secuencias de los ARNip se pueden encontrar en la Tabla complementaria 1. Las microinyecciones de ADNc se realizaron como se describe en 15,49 utilizando un sistema de microinyección Xenoworks (Sutter Instruments). Se crearon líneas celulares estables de fibroblastos NIH3T3 como se describe en 49, una que solo expresa Lifeact-mCherry y una segunda que coexpresa Lifeact-mCherry y GFP-KDEL. Los lentivirus se produjeron en células HEK293T (estructura principal de pLALI).

El ensayo de cicatrización de heridas y la transfección de ARNip se realizaron como se describió anteriormente50. Se cultivaron fibroblastos NIH3T3 en una placa de 10 cm hasta un 80% de confluencia. Para iniciar el ensayo de cicatrización de heridas, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en 10 ml de medio de crecimiento y se sembraron en placas de 6 pocillos. Cada pocillo debe contener un cubreobjetos lavado con ácido en el fondo y se llenó inicialmente con 1750 µl de medio de crecimiento (631-0851, VWR). Luego se agregaron 250 µl de las células resuspendidas y 500 µl de la mezcla de ARNip, por lo que el volumen final es de 2500 µl por pocillo. La mezcla de ARNip contenía ARNip a 20 nM y 5 µl de lipofectamina por pocillo. Las células se dejaron crecer durante 24 h y después de ese período se cambió el medio a medio de crecimiento. Después de reemplazar el medio, las células se dejaron crecer durante otras 24 h. Después de ese período, las células generalmente tenían entre 60 y 75% de confluencia y se les privaba de suero durante otras 48 h con medio libre de suero. Para inducir el movimiento nuclear, 96 h después de la transfección de ARNip, las células se lesionaron con una punta de pipeta de 20 µl y se estimularon con LPA 10 µM (L7260-1MG, Sigma-Aldrich). La estimulación con LPA tomó 2 h en todos los experimentos, excepto en el análisis de líneas TAN donde tomó solo 50 min (min). Después de la estimulación, las células se fijaron para inmunofluorescencia o se utilizaron para obtener imágenes en vivo. Para los experimentos que implican microinyección, las células se lesionaron y se microinyectaron con ADNc durante 2 h y solo después de ese tiempo de expresión, las células se estimularon con LPA.

Los fibroblastos NIH3T3 sembrados en placas de 10 cm se colocaron en hielo y se lavaron dos veces con PBS a 4 °C. Luego, las células se lisaron en 300 μL de tampón RIPA compuesto por Triton X-100 al 1%, NaCl 100 nM, Tris 10 mM, EDTA 1 mM y cóctel inhibidor de proteasa 1x (1:25, n.º 10085973 Fischer Scientific). Usando un raspador de células, las células se separaron de la placa y el lisado se transfirió a un tubo de 1,5 ml enfriado con hielo. Luego, los lisados ​​​​celulares se centrifugaron a 13 G, durante 10 minutos, a 4 ° C y los sobrenadantes se recogieron en un tubo nuevo de 1,5 ml enfriado con hielo. La concentración de proteína se midió con el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce) en un lector de microplacas Infinite M200 (Tecan). Se cargó una cantidad igual de proteína total en geles de proteína prefabricados Mini-PROTEAN® TGX 4-15% (BioRad) y se ejecutaron durante 60 minutos, a 80 voltios. Las proteínas del gel se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando un sistema de transferencia en seco iBlot Dry Blotting System (Invitrogen). Las membranas se sondaron utilizando anticuerpos primarios y secundarios incubados en PBS, Tween-20 al 0,1% y leche al 5%. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-Climp-63 de conejo (HPA041143, 1:500, Sigma-Aldrich), anti-vinculina de conejo (V9131, 1:500, Sigma-Aldrich), miosina-1C de conejo (HPA001768, 1:1000, Sigma-Aldrich), Reticulon-4 de conejo (HPA023977, 1:1000, Sigma-Aldrich) y Tubulina de ratón (T6557, 1:1000, Sigma-Aldrich). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron HRP anti-conejo (Thermo Scientific #31460, 1:5000) y HRP anti-ratón (Thermo Scientific #32430, 1:5000).

Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 5 minutos en un agitador orbital. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron en PBS que contenía suero de cabra al 10% (G9023-10ML, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda y luego se lavaron tres veces durante 10 minutos con PBS. Las células se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron tres veces durante 10 minutos con PBS y se montaron con Fluoromount-G (Invitrogen). Los anticuerpos principales utilizados para la inmunofluorescencia fueron: anti-β-Catenin de conejo (712700, 1:200, Invitrogen), anti-Pericentrin de ratón (611814, 1:200, BD-Biosciences), anti-Nesprin-2G de conejo (1:200 , regalo de Gregg Gundersen), anti-Kinectin-1 de conejo (HPA003178, 1:200, Sigma-Aldrich), anti-p180 de conejo (HPA011924, 1:200, Sigma-Aldrich), α-tubulina antitirosinada de rata (YL1 /2) (1:50, Colección europea de cultivos de células animales, Salisbury, Reino Unido), anti-GFP de pollo (GFP-1020, 1:1000, Aves Labs). Los anticuerpos secundarios anti-rata, anti-ratón, anti-conejo y anti-pollo utilizados fueron Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555 y Alexa Fluor 647 (1:800, Life Technologies). Se utilizó faloidina conjugada con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555 (A12379 y A34055, respectivamente, Life Technologies) para teñir actina filamentosa (dilución 1:200). Se utilizó DAPI para teñir el núcleo (1:10000, Sigma-Aldrich). Todos los anticuerpos y sondas que se utilizaron se enumeran en la Tabla complementaria 2.

Para experimentos de rescate, se sintetizó ADNc de Climp-63 de ratón (Life Technologies) en un vector de expresión pcDNA3.1 + N-eGFP de 6,1 Kb. Para probar las diferentes regiones de Climp-63 implicadas en el posicionamiento nuclear se sintetizaron cinco plásmidos diferentes: Climp-63 de longitud completa (Climp-63), dominio transmembrana más dominio citoplasmático (Cyto), dominio transmembrana más dominio luminal (Lum), un fosfo- Climp-63 mimético cuya interacción de microtúbulos se evita mediante la mutación de cuatro residuos de serina citosólica en ácido glutámico (-MT), y un Climp-63 deficiente en fósforo donde la interacción es permanente mediante la mutación de tres serinas en alaninas que no pueden fosforilarse (+ MONTE). La Tabla complementaria 3 incluye las secuencias del ADNc sintetizado. Todas las secuencias tienen mutaciones silenciosas para conferir resistencia contra los ARNip de Climp-63 utilizados. Todos los plásmidos también incluían una etiqueta GFP en el N-terminal. El ADNc de Lifeact-mCherry utilizado para generar la línea celular estable fue un regalo de Olivier Pertz. El GFP-KDEL utilizado como control fue generado en una publicación anterior51. GFP-mini-N2G, mCherry-mini-N2G y GFP-mN2GΔL fueron un regalo de Gregg Gundersen Lab12. GFP-INF2-CAAX y GFP-INF2-nonCAAX fueron obsequios de Henry Higgs Lab34. El HaloTag-Sec61 fue un regalo de Andrew Moore52. La Tabla complementaria 4 incluye todos los plásmidos utilizados para la microinyección.

Las células para FIB-SEM (U2OS) y TEM (NIH3T3) se fijaron durante 1 h a 4 °C en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,3, que contenía glutaraldehído al 2,5 % (v/v) y formaldehído al 0,1 % (v/v). . También se realizó un tratamiento postfijación de 1 h (sobre hielo) en tetróxido de osmio al 1% (ac.) y contraste de 30 min en bloque en acetato de uranilo al 1% (ac.). La deshidratación se realizó utilizando un gradiente de etanol (50-70-95-100%). Las muestras se embebieron planamente en resina Durcupan y se endurecieron a 60 °C durante 72 h.

Para las imágenes TEM, se pegaron dos bloques para permitir el corte sagital manteniendo la integridad de la muestra. Los bloques se seccionaron utilizando un ultramicrótomo Reichert Supernova (Leica microsystems©). Se obtuvieron secciones ultrafinas (70 nm), se recogieron en rejillas de ranuras de cobre recubiertas de formvar (AGAR Scientific©) y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo. (Receta Reynolds). Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7650 a 100 kV de aceleración para la adquisición de imágenes. Para las imágenes FIB-SEM, las imágenes se adquirieron utilizando un Crossbeam 540 (Carl Zeiss).

Las imágenes de microscopía óptica se realizaron utilizando una amplia variedad de técnicas de imagen y microscopios. Para la inmunofluorescencia para la validación de ARNip, así como para la cuantificación del posicionamiento nuclear, la actina ventral y dorsal y las líneas TAN, se tomaron imágenes de las células utilizando un microscopio de campo amplio Zeiss Cell Observer invertido controlado por ZEN Blue Edition (Zeiss). Para la validación de ARNip y el posicionamiento nuclear, utilizamos un objetivo de aceite EC Plan-Neofluar ×40/0,75 M27, mientras que para la cuantificación de líneas TAN se utilizó un objetivo de aceite ×63/1,4 Plan-Apochroma DIC M27. La celda Zeiss observada estaba equipada con una cámara sCMOS (ORCA-flash4.0 V2, adquisición de transmisión de 10 ms/cuadro, Hamamatsu) y una fuente de luz LED Colibri2 (Zeiss).

Se utilizó un microscopio confocal invertido de disco giratorio Zeiss Cell Observer para el análisis de imágenes en lapso de tiempo del seguimiento del movimiento nuclear, el flujo retrógrado de actina y la acumulación perinuclear del RE durante el posicionamiento nuclear. Este microscopio está equipado con una cámara de 37 °C y 5% de CO2 adecuada para microscopía de células vivas, una cámara EM-CCD (Evolve 512, Photometrics), un escáner confocal de disco giratorio (CSU-x1, Yokogawa) y una fuente de luz LED Colibri2. (Zeiss), un objetivo de aceite Plan-Apocromático ×63 (NA = 1,4) con un láser de estado sólido de 405 nm (potencia máxima de 50 mW) y un láser de 561 nm (potencia máxima de 75 mW). Además, este microscopio tiene un filtro de emisión BP 450/50 de 425–475 nm y un filtro de emisión BP 600/50 de 575–625 nm.

Se utilizó microscopía de iluminación estructural (SIM) para el análisis y cuantificación de las fibras de estrés de actina ventral que se envuelven por ER durante la obtención de imágenes en vivo de posicionamiento nuclear, así como para analizar y cuantificar el área de ER ventral nuclear y colocalización, ER ventral y actina ventral. Microscopio Ti2-E equipado con una cámara ORCA-Flash 4.0 sCMOS (Hamamatsu Photonics), unidad iluminadora N-SIM E, configuración de doble capa con unidad Perfect Focus, Piezo Stage, Ti2-FTQ N-SIM Torreta de filtro motorizada de cuatro bandas, Ti2- P-FWB-E Unidad láser y rueda de filtro BA motorizada Unidad láser LU-N3-SIM de 488 nm y 561 nm. El microscopio se controló con el software NIS-Elements (Nikon). Se utilizó un objetivo de aceite CFI SR HP Apocromático TIRF NA 1,49 × 100C.

Se utilizó microscopía confocal de barrido de puntos para analizar la morfología del RE, así como para analizar y cuantificar el área del RE ventral nuclear y la colocalización, el RE ventral y la actina ventral. Se utilizaron dos microscopios, el Zeiss LSM 710 de escaneo puntual (morfología ER) y el LSM 880 (morfología ER, análisis de ER ventral y análisis cuantitativo del área ventral de ER y colocalización de actina, ER y actina). El Zeiss LSM 710 está equipado con un objetivo de aceite Plan-Apocromático DIC M27 63/1.4, cámara de 37 °C y 5% de CO2 para imágenes en vivo, láser de diodo 405-30 (405 nm), láser de argón (458, 488 y 514 nm). ), láser DPSS 561-10 (561 nm) y láser HeNe633 (633 nm) y se controla con el software Zen Black. El Zeiss LSM 880 es un microscopio confocal invertido de barrido puntual equipado con una cámara de 37 °C, 5 % de CO2 y enfoque definido para microscopía de células vivas. Este microscopio está controlado con ZEN Black (Zeiss) y está equipado con un detector Airyscan con área de 32 canales (resolución de 140 nm lateralmente y 400 nm axialmente, a 488 nm) y un detector GaAsP (fotomultiplicador 45% QE) y un microscopio de 488 nm. Unidad láser de argón (potencia máxima de 25 mW). Para obtener imágenes en vivo se utilizó un soporte para cubreobjetos (CM-S22-1 y CM-B25-1, Live Cell Instrument Co). Se utilizó un objetivo Plan-Apocromático Oil NA 1.4 de 63x con una distancia de trabajo de 0,19 mm y se adquirieron pilas Z de 220 nm.

Las imágenes fueron preprocesadas usando ImageJ para seleccionar regiones de interés. Cada fila tenía un tamaño de alrededor de 300 × 300 píxeles. Se aplicó un filtro de mediana 3D para eliminar el ruido de sal y pimienta antes de la segmentación. Para crear un modelo 3D de la intrincada estructura de la sala de emergencias, primero segmentamos la estructura utilizando el algoritmo de tallado en Ilastik. La segmentación se redefinió iterativamente y la malla final se exportó y renderizó usando Blender. Las imágenes originales se superpusieron a la estructura renderizada utilizando Neuromorph. Cada rebanada tenía un espesor de 8 nm. Las imágenes representativas son diferentes cortes de la muestra, con un intervalo espacial de 560 nm en Z.

Los datos FIB-SEM se cuantificaron utilizando estereología como se describe en la ref. 53. Para estimar el volumen, se utilizaron 18 cortes de la pila completa (correspondientes a un volumen total de 0,60 µm3) (1 imagen cada 10 en una pila de 180 cortes). Se aplicó una cuadrícula de sondas de puntos de prueba con un desplazamiento aleatorio a las imágenes usando ImageJ, y el número de puntos que aterrizaron en la sala de emergencias se contó manualmente y el volumen se calculó usando el estimador de Cavalieri.

El posicionamiento nuclear se cuantificó utilizando un software automatizado desarrollado por el laboratorio de Gregg Gundersen, Cell Plot (http://www.columbia.edu/~wc2383/software.html). El eje de polaridad coincide con la dirección de la herida. El software proporciona automáticamente las coordenadas de los centroides nucleares y celulares. El software calcula el posicionamiento nuclear como la distancia entre el centroide nuclear y el centroide de la célula. Esta distancia se representa en diagramas de caja con bigotes correspondientes al percentil 10 al 90 del porcentaje del radio de la celda.

Las imágenes de núcleos marcados (DAPI) se segmentaron manualmente con la imagen J y se extrajeron las regiones 2D correspondientes para medir la redondez, la circularidad y el perímetro.

La redondez es una medida para capturar información de forma. La redondez nuclear se calculó utilizando la fórmula: (4 ∗área)/(π*eje mayor²), donde el eje mayor se calculó ajustando una elipse a la forma del núcleo54. La circularidad nuclear captura la suavidad del perímetro y no la forma estructural general. Se calculó usando la fórmula: 4 *π*(área/perímetro2)55. El perímetro se calculó utilizando la longitud del límite exterior de la selección (núcleo).

El análisis de seguimiento nuclear se basó en microscopía de lapso de tiempo. Se tomaron imágenes de las células cada 5 minutos durante 120 minutos de estimulación con LPA utilizando un disco giratorio. Se utilizaron células estables que expresan GFP-KDEL para determinar la posición nuclear en cada cuadro. Para la cuantificación del seguimiento nuclear, se utilizó el complemento de seguimiento manual de Image J. Para este análisis, se midieron las coordenadas del centroide del núcleo en cada momento. Los gráficos de seguimiento nuclear, la persistencia y la persistencia yy se calcularon utilizando Chemotaxis and Migration Tool (Ibidi). La persistencia corresponde a la franqueza y la persistencia YY corresponde al índice de migración hacia adelante paralelo en Chemotaxis and Migration Tool.

Se tomaron imágenes individuales de células vivas de fibroblastos del borde de la herida que expresaban GFP-KDEL entre 1h15 y 1h45min después de la estimulación con LPA, en un microscopio confocal de barrido puntual Zeiss LSM 880. Se dibujó un retorno de la inversión que incluía el área total de la celda y se cuantificó la intensidad media de GFP-KDEL.

Para analizar la morfología del RE y la compactación perinuclear del RE, se tomaron imágenes individuales de células vivas que expresan GFP-KDEL entre 1h15 y 1h45min después de la estimulación con LPA, en un microscopio confocal de barrido puntual Zeiss LSM 880. Para las células no tratadas con LPA, la imagen se realizó 1h45 después de rascarse la herida. Las imágenes representativas representan una sola Z. Para ambos experimentos, las imágenes se realizaron a 37 °C y 5% de CO2.

Para analizar la acumulación perinuclear de ER, se midió la intensidad de fluorescencia de KDEL-GFP en la región ventral, perinuclear y dorsal de la célula. Para las regiones ventral y dorsal seleccionamos un plano Z donde pudimos detectar el ER ventral y seleccionamos un ROI que solo incluía la región nuclear y se midió la intensidad de la fluorescencia. Para normalizar la intensidad, cada intensidad de fluorescencia se normalizó a la intensidad total de la célula en cada punto de tiempo. Se utilizó el mismo procedimiento para medir el ER ventral y dorsal. Para medir el ER perinuclear, se trazó un escaneo lineal alrededor del núcleo y cada escaneo lineal tenía un espesor de 3 µm. La intensidad media de fluorescencia de GFP se normalizó de acuerdo con la intensidad total de GFP de la célula en cada punto de tiempo.

Para analizar la actina filamentosa ventral y dorsal, adquirimos imágenes de células del borde de la herida estimuladas con LPA durante 2 h, fijadas y teñidas con faloidina-Alexa Fluor 647, centrándonos en el lado dorsal y ventral de las células. Luego calificamos el número de fibras de tensión ventrales y cables de actina dorsales por núcleo.

Para la cuantificación de líneas TAN, se microinyectaron células muertas de hambre en el borde de la herida WT con GFP-mini-N2G y, después de 2 h de expresión, las células se estimularon con LPA durante 50 minutos. Las células se fijaron e inmunomarcaron para GFP y se tiñeron para actina filamentosa con faloína-Alexa 647. Cuantificamos el número de líneas TAN por núcleo (número de líneas colocalizantes de Nesprin-2G y cables dorsales de actina) y el porcentaje de núcleos con líneas TAN ( porcentaje de núcleos con, al menos, una línea TAN).

Para analizar el flujo retrógrado de actina, realizamos microscopía de lapso de tiempo de células del borde de la herida transfectadas de manera estable con Lifeact-mCherry y estimuladas con LPA. Las imágenes se adquirieron cada 5 m durante 2 h. Generamos quimógrafos utilizando regiones rectangulares perpendiculares al borde de la herida, desde el borde anterior hasta la parte posterior del núcleo (2,3 µm de ancho).

Para calcular la velocidad del flujo retrógrado de actina utilizamos trigonometría. En primer lugar, para calcular el desplazamiento espacial comenzamos trazando una línea en el quimógrafo desde el primer punto de tiempo hasta el último donde podíamos visualizarlo continuamente. Sin embargo, el desplazamiento espacial real del cable de actina corresponde a la distancia en Y desde la coordenada del primer punto de tiempo hasta el último punto de tiempo (collar opuesto). Para calcular el collar opuesto multiplicamos la hipotenusa (la distancia entre el primer y el último punto de tiempo) por el pecado del ángulo entre la hipotenusa y el borde de ataque. La duración temporal, en minutos, para el desplazamiento del cable de actina corresponde al número de puntos de tiempo donde lo visualizamos multiplicado por 5. Además, también cuantificamos el porcentaje de células donde el flujo se movió hacia adelante, hacia atrás o no se movió en absoluto. Se consideró que los cables de actina que se movían hacia el borde de ataque se movían hacia adelante, los cables de actina que se movían hacia la parte trasera de la celda se consideraban que se movían hacia atrás y los filamentos de actina que no se movían se consideraban detenidos.

Para analizar cómo Climp-63 afectó la envoltura del ER de las fibras de actina durante el posicionamiento nuclear, se estimularon células que coexpresaban Lifeact-mCherry y GFP-KDEL con LPA y se tomaron imágenes con microscopía de lapso de tiempo. Las células se estimularon en el momento cero y el primer cuadro se adquirió en el momento 60 min. Se adquirió un fotograma cada 15 min durante 60 min. En cada punto de tiempo se adquirió una pila AZ de 1 µm con un paso Z de 120 nm. Además, para analizar el área ventral de ER y la colocalización de actina, se tomaron imágenes de ER y actina debajo de las células del núcleo después de 1 h de estimulación con LPA y se adquirieron pilas Z en instantáneas individuales (LSM 880 y SIM). Los experimentos de microscopía SIM se realizaron utilizando el objetivo ×100 de Nikon N-SIM E a 37 °C y las células se trataron con HEPES a 20 mM para estabilizar el pH durante la adquisición. El análisis de imágenes se realizó utilizando ImageJ.

El porcentaje de células con protección de actina por ER se cuantificó manualmente a partir de pilas Z de imágenes de actina ventral y ER. Las células obtuvieron una puntuación positiva cuando se observó al menos un evento en el que el RE formó un gancho o se envolvió alrededor de las fibras de estrés de actina en al menos dos puntos de tiempo consecutivos.

El área del RE ventral y la colocalización de actina se midió en células que expresan GFP-KDEL o HaloTag-Sec61 marcadas con el ligando Janelia Fluor® 646 HaloTag® (Promega, #GA1120) (para marcar el RE) y LifeAct-mCherry (para marcar los filamentos de actina). ). Se usó una máscara correspondiente al núcleo para seleccionar ER ventral y actina. Las imágenes de ER fueron de umbral y se creó una máscara binaria. Las máscaras binarias de filamentos de actina se generaron manualmente. El área de superposición entre el RE y los filamentos de actina se calculó con Image Calculator en la Imagen J. El área de colocalización se normalizó para el área de actina ventral por núcleo. Para cuantificar el porcentaje del cable de actina cubierto por ER, se calculó la relación entre el área de ER y el área del cable de actina.

Para analizar la localización de Climp-63, se microinyectaron células de ARNip de Climp-63 con HaloTag-Sec61 y Climp-63-GFP. Para cuantificar el área de Climp-63 por área total de ER, se calculó la relación entre el área de Sec61 y el área de Climp-63. Se utilizó el método de umbral para generar las máscaras de tinción. La cuantificación se realizó tanto en la región ventral como en la región dorsal de la célula.

Se realizaron experimentos de rescate para rescatar el posicionamiento nuclear mediante la microinyección de diferentes construcciones en células de vanguardia heridas y agotadas de Climp-63. Las células se microinyectaron después de 48 h de inanición y el ADNc se expresó durante 2 h antes de la estimulación con LPA. Después de 2 h de estimulación con LPA, las células se fijaron y tiñeron para la cuantificación del posicionamiento nuclear. Para probar la relevancia de los diferentes dominios Climp-63 para el posicionamiento nuclear, se microinyectaron células agotadas en Climp-63 con KDEL (control), Climp-63 de longitud completa, dominio citoplasmático de Climp-63 (Cyto), dominio luminal de Climp-63 (Lum ), Climp-63 (-) MT y Climp-63 (+) MT. Para probar si el efecto del agotamiento de Climp-63 se debió a la pérdida de puntos de interacción ER-actina, se microinyectaron células agotadas de Climp-63 con GFP-KDEL (control), GFP-mini-N2G carecía del dominio KASH (m-N2GΔL) , GFP-INF2-CAAX y GFP-INF2-no CAAX. Para garantizar que la eliminación de ARNip fuera eficiente en cada cubreobjetos microinyectados donde se cuantificó el posicionamiento nuclear, se midió el posicionamiento nuclear en células no microinyectadas y se excluyeron los cubreobjetos donde la transfección de ARNip fue ineficiente.

Software ImageJ FIJI (disponible en https://fiji.sc/). Se utilizó el software Fiji como software de procesamiento de imágenes y para cuantificar la acumulación perinuclear de ER; Líneas de bronceado; dirección del flujo retrógrado de actina; actina ventral y dorsal; área de ER nuclear ventral y colocalización de actina, ER y actina; seguimiento nuclear durante el movimiento nuclear; Ancho luminal del RE, área del RE, ancho luminal de la envoltura nuclear; Nesprin-2G significa fluorescencia. Se utilizó Adobe Illustrator para ensamblar los paneles de figuras.

Se utilizó el software Graphpad Prism 8 para analizar y representar los datos. Se realizaron comparaciones no apareadas con la prueba t de Student, suponiendo una varianza igual para ambas poblaciones y una distribución gaussiana (prueba t no apareada de dos colas). La distribución de los puntos de datos se expresa como media ± SEM de tres o más experimentos independientes y la línea indica el valor medio. No se eliminaron valores atípicos. Las imágenes representativas provienen de al menos 3 experimentos, excepto las imágenes FIB-SEM y EM, donde se adquirió una célula por tratamiento en un total de un experimento. Los valores de p se presentan de la siguiente manera: ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Todos los datos FIB-SEM se depositan en EMPIAR con los códigos de acceso EMPIAR-11002 y EMPIAR-11003. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Henry Higgs, Andrew Moore, Alexander Palazzo y Gregg Gundersen por los reactivos. Agradecemos a todos los miembros de los laboratorios Edgar Gomes, Cláudio Franco y Vanessa Morais, así como a Bruno Cadot, Sérgio Dias y Florence Janody por las discusiones y el apoyo. Agradecemos el apoyo de toda la comunidad iMM. Agradecemos a las siguientes instalaciones de iMM; Bioimagen, Patología Comparada, Citometría de Flujo, Roedores y Pez Cebra. Agradecemos al Centro Central de Microscopía Electrónica del EMBL, especialmente a Yannick Schwab. Agradecemos a Guy Riddihough (Life Science Editors) por ayudar con la edición del manuscrito. Agradecemos a Nikon Instruments por el préstamo del equipo. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación H2020-GA 810207-ARPCOMPLEXITY y FP7-GA 617676 PHONICS (ERG), instalación EMBO (ERG), beca del Centro Whitman del Laboratorio de Biología Marina (ERG), Association pour la Recherche sur le Cancer y La Ligue Nacionale contre le Cancer (ERG) y Fundação para a Ciência ea Tecnologia (SFRH/BD/112286/2015)(CJ), Consejo Europeo de Investigación H2020-GA 679368 AXIAL.EC (CF); Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC/MED-PAT/31639/2017; CEECIND/04251/2017)(CF) y Fondation LeDucq (17CVD03)(CF).

Andreia Pinto

Dirección actual: Royal Brompton Hospital y Harefield NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Anna Pezzarossa y Pedro Campinho

Dirección actual: Fundación Champalimaud, Centro Champalimaud para lo Desconocido, Lisboa, Portugal

Pedro Machado

Dirección actual: Centro de Imágenes Ultraestructurales, King's College London, Londres, Reino Unido

Instituto João Lobo Antunes de Medicina Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Lisboa, Lisboa, Portugal

Cátia Silva Janota, Andreia Pinto, Anna Pezzarossa, Judite Costa, Pedro Campinho, Cláudio A. Franco y Edgar R. Gomes

Instalación central de microscopía electrónica (EMCF), Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Heidelberg, Alemania

Pedro Machado

Instituto de Histología y Biología del Desarrollo, Facultad de Medicina, Universidad de Lisboa, Lisboa, Portugal

Claudio A. Franco y Edgar R. Gomes

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CSJ y ERG concibieron y diseñaron los experimentos. CSJ realizó los experimentos, con excepción del procedimiento experimental FIB-SEM y TEM. La adquisición de FIB-SEM fue realizada por JC, A.Pi. y PM, la representación 3D y la cuantificación de los datos FIB-SEM que realizó A.Pe. La preparación de muestras TEM y la adquisición de imágenes realizadas por A.Pi., CSJ y ERG analizaron los datos. CSJ y ERG escribieron el manuscrito. PC y CAF proporcionaron datos no publicados. Todos los autores participaron en la revisión crítica y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Edgar R. Gomes.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Janota, CS, Pinto, A., Pezzarossa, A. et al. El blindaje de la actina por parte del retículo endoplásmico afecta el posicionamiento nuclear. Nat Comuna 13, 2763 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30388-3

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Recibido: 14 de octubre de 2021

Aceptado: 28 de abril de 2022

Publicado: 19 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30388-3

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