La adaptación a la luz no previene las anomalías tempranas de la retina en ratas diabéticas

Scientific Reports volumen 6, número de artículo: 21075 (2016) Citar este artículo

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La etiología de la retinopatía diabética (RD), la principal causa de ceguera en el mundo desarrollado, sigue siendo controvertida. Una hipótesis sostiene que la hipoxia retiniana, exacerbada por el alto consumo de O2 de los fotorreceptores de bastones en la oscuridad, es la causa principal de RD. Con base en esta predicción, investigamos si las anomalías retinianas tempranas en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina se alivian al evitar que los bastones se adapten a la oscuridad. Las ratas diabéticas y sus compañeros de camada no diabéticos se alojaron en un fotociclo de luz tenue de 12:12 horas (30 lux durante el día y 3 lux durante la noche). La progresión de las anomalías retinianas tempranas en ratas diabéticas se evaluó mediante la monitorización de la onda b del ERG y los potenciales oscilatorios, la gliosis reactiva de las células de Müller y la muerte de las células neuronales, según lo analizado mediante tinción TUNEL y el espesor de la retina a las 6 y 12 semanas después de la inducción de la diabetes. Mantener a los animales diabéticos en una luz de adaptación tenue no ralentizó la progresión de estos cambios neuronales y gliales en comparación con las ratas diabéticas mantenidas en un fotociclo estándar de luz y oscuridad de 12:12 horas (30 lux durante el día y 0 lux durante la noche). Nuestros resultados indican que las anomalías neuronales y gliales en las primeras etapas de la diabetes no se ven exacerbadas por el consumo de O2 de los fotorreceptores de bastón en la oscuridad.

La retinopatía diabética (RD) es una complicación grave de la diabetes tipo 1 y 2 y una de las principales causas de discapacidad visual y ceguera1. Con la actual epidemia de diabetes tipo 2, la RD se convertirá en un problema de salud aún más grave en las próximas décadas.

Los pasos iniciales que conducen a la RD no han sido completamente dilucidados. Una hipótesis sobre la etiología de la RD sostiene que el flujo sanguíneo comprometido en las primeras etapas de la enfermedad produce hipoxia retiniana. Aunque la evidencia de hipoxia en la República Dominicana es controvertida, algunos estudios apoyan la hipótesis. En experimentos psicofísicos con pacientes diabéticos, la sensibilidad al contraste reducida y la percepción de la visión del color se restablecen cuando los pacientes respiran O22,3 al 100%. En modelos animales de diabetes, el etiquetado de pimonidazol4, la expresión del factor 15 inducible por hipoxia y los perfiles de PO2 intrarretiniana en gatos diabéticos durante 6 años6 indican hipoxia retiniana.

GB Arden ha sugerido que la alta demanda metabólica de los fotorreceptores en la oscuridad exacerbará la hipoxia retiniana y puede ser la causa principal de DR7. Ha propuesto que evitar que los fotorreceptores de bastón se adapten a la oscuridad, lo que reducirá significativamente su demanda metabólica, puede disminuir la hipoxia y retardar la progresión de la RD. En apoyo de esta hipótesis, Arden ha descubierto en ensayos preliminares en pacientes diabéticos que la exposición a la luz durante la noche para evitar que los bastones se adapten a la oscuridad produce una mejora de la función visual y una regresión del edema macular en pacientes diabéticos8,9.

La retinopatía diabética se ha considerado tradicionalmente una enfermedad de la vasculatura retiniana. Sin embargo, existe evidencia sólida de que la disfunción neuronal y glial precede a las lesiones vasculares manifiestas y desempeña un papel en el desarrollo de DR10. Tanto en pacientes como en modelos animales de diabetes hay una pérdida de neuronas retinianas en las primeras etapas de la progresión de la enfermedad11. La disfunción neuronal se refleja en alteraciones en el electrorretinograma (ERG)12,13. Además, en respuesta a la hipoxia retiniana, las células de Müller (las principales células gliales de la retina) se activan y regulan positivamente factores proangiogénicos y de permeabilidad vascular como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)10,14, lo que puede contribuir al desarrollo de síntomas clínicos. de retinopatía.

Ahora hemos evaluado si prevenir la adaptación a la oscuridad reduce los cambios neuronales y gliales tempranos en la retina diabética en un modelo de diabetes tipo 1 en ratas. Descubrimos que prevenir la adaptación a la oscuridad manteniendo ratas diabéticas en condiciones de poca luz durante la noche no frena la progresión de las anomalías retinianas tempranas, según lo evaluado por los cambios en el ERG, la gliosis reactiva de las células de Müller y la muerte de las células neuronales, analizadas mediante tinción TUNEL y espesor de la retina.

Probamos la hipótesis de que prevenir la adaptación a la oscuridad ralentiza la progresión de anomalías retinianas tempranas en ratas diabéticas utilizando el modelo animal de diabetes tipo 1 con estreptozotocina (STZ). Se trataron ratas Sprague-Dawley con una única inyección de STZ o tampón citrato y se evaluó semanalmente la glucosa sérica. Las ratas tratadas con STZ se volvieron hiperglucémicas dentro de los 3 días posteriores a la inyección y las concentraciones de glucosa permanecieron elevadas durante todo el estudio (Tabla 1). Las ratas se alojaron en un fotociclo de luz-oscuridad o luz-tenue de 12:12. Los animales alojados en condiciones estándar de luz y oscuridad se mantuvieron a 30 lux – 0 lux, mientras que los animales alojados en condiciones de adaptación a la oscuridad se mantuvieron a 30 lux – 3 lux. Se evaluó la progresión de las anomalías retinianas en las ratas a las 6 y 12 semanas después de la inducción de la diabetes.

Las ratas alojadas en condiciones de adaptación a la oscuridad se mantuvieron en una habitación con una intensidad de luz ambiental dentro de las jaulas de 3,0 ± 0,9 lux durante la noche subjetiva para evitar la adaptación a la oscuridad de los fotorreceptores de bastón. Evaluamos si una iluminación de 3 lux era suficiente para adaptar las barras a la luz midiendo los cambios en el ERG bajo diferentes niveles de iluminación de fondo.

Los ERG flash se registraron en ratas de control (no diabéticas) en la oscuridad (0 lux) y con tres intensidades de luz de fondo (0,3, 3 y 30 lux). Tanto la onda a como la onda b se redujeron significativamente con niveles de luz de fondo tan bajos como 0,3 lux (Fig. 1a-c), lo que demuestra que esta luz de iluminación de adaptación tenue adapta la retina.

(a) Respuestas de ERG a estímulos de destello de 1,50 log cd.s/m2 registrados en condiciones adaptadas a la oscuridad (fondo de 0 lux) y adaptadas a la luz y la oscuridad (intensidades de luz de fondo de 0,3, 3 y 30 lux). ( b, c ) Relaciones intensidad-respuesta para la onda a (b) y la onda b (c) en diferentes condiciones de iluminancia de fondo. N = 5 ratas. Los niveles de luz de fondo tan bajos como 0,3 lux adaptan la retina. ***P < 0,001 para comparaciones múltiples entre '0 lux' e intensidades de luz de fondo de 0,3, 3 y 30 lux. Las barras de error aquí y en otras figuras indican ± sem

Evaluamos la progresión de las anomalías retinianas inducidas por la diabetes en ratas alojadas en condiciones de iluminación estándar y adaptadas a la luz tenue. Se midieron los cambios en el ERG, la gliosis reactiva de las células de Müller, la apoptosis neuronal y la reducción del grosor de la retina, una medida de la pérdida de células de la retina.

Se registraron la onda b del ERG, que refleja la función de las células bipolares, y los potenciales oscilatorios (OP), que reflejan principalmente la actividad de las células amacrinas15. Estos potenciales ERG muestran cambios característicos en etapas tempranas de la patología retiniana en pacientes diabéticos y en animales diabéticos12,13. Nuestros resultados fueron consistentes con estudios previos. Hubo una reducción significativa en la amplitud de la onda b adaptada a la luz y la oscuridad tan pronto como 6 semanas después de la inducción de la diabetes, en comparación con las ratas de control de la misma edad (Fig. 2a-d). Además, las ratas diabéticas mostraron respuestas OP significativamente retrasadas a partir de las 6 semanas de diabetes (Fig. 2e, f).

Los paneles de la izquierda muestran formas de onda ERG representativas de ratas diabéticas durante 12 semanas (trazos rojos) y controles de la misma edad (trazos negros) alojados en condiciones de iluminación estándar. Los paneles de la derecha muestran un resumen de las relaciones intensidad-respuesta. (a,b) Retinas adaptadas a la luz. Las respuestas en (a) son para un destello de 2,17 log cd.s/m2. Las amplitudes de la onda b se muestran en (b). (c,d) Retinas adaptadas a la oscuridad. Las respuestas en (c) son para un destello de 1,50 log cd.s/m2. Las amplitudes de la onda b se muestran en (d). (e,f) Potenciales oscilatorios. Las respuestas en (e) son para un destello de 1,50 log cd.s/m2. La suma del tiempo hasta el pico de los potenciales oscilatorios (TTP) para OP1 a OP4 se muestra en (f). En los paneles de la derecha, ratas diabéticas durante 6 y 12 semanas (Db) y controles de la misma edad (Ctrl), alojados bajo Se muestran condiciones de iluminación estándar (0 lux, trazos continuos) o condiciones nocturnas tenuemente adaptadas (3 lux, trazos discontinuos). Las ratas diabéticas tenían amplitudes de onda b reducidas y una mayor latencia de los OP tanto a las 6 como a las 12 semanas de diabetes, en comparación con los controles. Las condiciones de alojamiento (estándar frente a adaptación tenue) no afectaron la amplitud de la onda b ni el retraso del potencial oscilatorio. Los números entre paréntesis indican el número de ratas. §, no significativo para la comparación entre grupos de diabéticos; *P < 0,05, para comparación entre cada grupo de diabéticos y el control de la misma edad. ##P <0,01 y ###P <0,001 para comparación entre ratas diabéticas estándar a las 6 y 12 semanas. xP <0,05 y xxxP <0,001 para comparación entre grupos de control a las 6 y 12 semanas (estándar en (b) y adaptación tenue en (d)).

Sin embargo, no hubo diferencias en las respuestas de ERG entre ratas diabéticas alojadas en condiciones de iluminación estándar y adaptadas a la luz tenue. Los cambios en las amplitudes de la onda b y en los retrasos de la OP fueron similares en los dos grupos de animales.

La gliosis reactiva de células de Müller es una característica distintiva de la enfermedad de la retina y se observa en pacientes diabéticos y en modelos animales de diabetes5,16. Evaluamos la expresión del filamento intermedio, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), en secciones transversales de la retina para evaluar la progresión y la gravedad de la reactividad de las células de Müller.

La gliosis de células de Müller, evidenciada por una regulación positiva de GFAP, fue evidente a las 6 semanas de diabetes en la retina central y media, y a las 12 semanas en la retina periférica (Fig. 3). Los animales de control (no diabéticos) mostraron poca gliosis. Sin embargo, el porcentaje de células de Müller que expresaban GFAP fue similar en ratas diabéticas alojadas en condiciones estándar y con poca luz.

(a) Marcado inmunohistoquímico para la enzima glutamina sintetasa específica de las células de Müller (GS, rojo) y para GFAP (verde) de ratas diabéticas durante 12 semanas (paneles inferiores) y controles de la misma edad (paneles superiores) alojados en condiciones de iluminación estándar. La tinción nuclear DAPI se muestra en azul. En las retinas de control, las células de Müller mostraron poco etiquetado para GFAP, con expresión restringida a los astrocitos (flechas) en la superficie de la retina y a lo largo de los vasos penetrantes. En ratas diabéticas, las células de Müller mostraron un aumento de la gliosis (procesos positivos para GS que también eran positivos para GFAP; puntas de flecha). Para esto y Fig. 4, GCL, capa de células ganglionares; IPL, capa plexiforme interna; INL, capa nuclear interna; OPL, otra capa plexiforme, ONL, capa nuclear externa; PL, capa de fotorreceptores. Barra de escala: 50 μm. (b) Datos resumidos de la gliosis de células de Müller (porcentaje de procesos positivos para GS en la IPL que también fueron positivos para GFAP), a las 6 y 12 semanas en retina periférica, media y central en ratas control (Ctrl) y diabéticas (Db) alojadas en condiciones estándar (0 lux) o tenue adaptadas por la noche (3 lux). Las células de Müller en la retina media y central muestran un aumento de la gliosis a las 6 y 12 semanas de diabetes, y en la retina periférica a las 12 semanas. Las condiciones de vivienda (estándar o de adaptación a la oscuridad) no afectaron el grado de gliosis ni a las 6 ni a las 12 semanas. Los números entre paréntesis indican el número de ratas. ***P < 0,001 en comparación con el control de la misma edad.

La muerte de las células neuronales, indicada por la tinción con TUNEL, y la consiguiente disminución del grosor de la retina, se observa tanto en pacientes diabéticos como en ratas diabéticas tratadas con STZ11. Observamos un aumento significativo de células TUNEL positivas en las retinas de ratas diabéticas de 6 semanas (Fig. 4a, b). Aproximadamente el ochenta y seis por ciento de estas células TUNEL positivas se observaron en la capa nuclear externa. La evaluación morfológica de las secciones de retina reveló una disminución en el grosor de la retina en ratas diabéticas a las 6 semanas (solo 3 lux) y a las 12 semanas (ambos grupos diabéticos) (Fig. 4c).

(a) Tinción TUNEL en secciones transversales de retina de ratas diabéticas durante 6 semanas y controles de la misma edad, alojados en condiciones de iluminación estándar. Se muestran núcleos marcados con DAPI (azul) y una célula TUNEL positiva (azul/verde; flecha). Barra de escala: 50 μm. (b) Número medio de células TUNEL positivas de secciones de retina de 12 micrones de espesor a través del disco óptico, normalizadas a la longitud del corte de retina. (c) Espesor total de la retina en ratas control (Ctrl) y diabéticas (Db), alojadas en condiciones estándar (0 lux) o adaptadas a la oscuridad durante la noche (3 lux). Los números entre paréntesis indican el número de ratas. *P < 0,05, ***P < 0,001 frente a control de la misma edad; #P <0,05 comparación entre ratas diabéticas adaptadas a la luz tenue a las 6 y 12 semanas.

Las ratas diabéticas alojadas en condiciones de luz tenue y estándar mostraron aumentos similares en las células TUNEL positivas y disminuciones similares en el grosor de la retina. La única excepción fue el espesor de la retina a las 6 semanas, donde las ratas alojadas en condiciones de luz tenue mostraron una disminución en el espesor de la retina mientras que las ratas alojadas en condiciones de luz estándar no lo hicieron. Este resultado podría deberse al daño causado por la luz de adaptación tenue de 3 lux. A las 12 semanas, se hizo evidente una reducción del espesor de la retina en ambos grupos de diabéticos.

Hemos evaluado si prevenir la adaptación a la oscuridad con una luz de adaptación tenue ralentiza el desarrollo de anomalías neuronales y gliales tempranas en ratas diabéticas. Nuestros resultados indican que el desarrollo de estas anomalías retinianas tempranas inducidas por la diabetes no se frena, al menos en nuestro modelo animal de diabetes.

Descubrimos que las ratas diabéticas alojadas en condiciones de iluminación tenue durante la noche para evitar la adaptación a la oscuridad mostraron un grado similar de anomalías retinianas que las ratas alojadas en condiciones de iluminación estándar (0 lux) durante la noche. Esto fue cierto tanto a las 6 como a las 12 semanas después de la inducción de la diabetes y para múltiples medidas de función y morfología de la retina, incluidas alteraciones del ERG, gliosis reactiva de células de Müller y muerte celular, según lo analizado mediante tinción TUNEL y espesor de la retina. Sin embargo, cabe señalar que la pérdida de células neuronales en la diabetes se produce predominantemente en la retina interna17,18. Por lo tanto, la pérdida celular que observamos, principalmente en los fotorreceptores, podría no ser relevante para el desarrollo de la RD.

Hay varias razones posibles por las que la adaptación a la luz no logró frenar la progresión de las anomalías de la retina. Es posible que la luz de adaptación de 3 lux que se utilizó para evitar la adaptación de los bastones a la oscuridad durante la noche no haya sido lo suficientemente brillante como para reducir suficientemente el metabolismo de los fotorreceptores. Sin embargo, esto es poco probable, ya que una luz de fondo de 0,3 lux fue suficiente para causar reducciones significativas en la sensibilidad de la retina, medida por las amplitudes de las ondas a y b del ERG. Además, la luz adaptada de 3 lux que utilizamos era similar en intensidad a la luz adaptada utilizada por Arden en sus ensayos clínicos en pacientes diabéticos8,9. En su estudio de DR de 20108, se utilizó un parche luminoso junto al ojo para adaptar la retina a la luz. La mancha luminosa tenía una luminancia de ~10 cd/m2. Teniendo en cuenta la transmitancia del 0,3% del párpado humano para la luz verde19, esto equivale a una iluminancia de 0,3 lux en la superficie del globo.

También se pueden haber obtenido resultados negativos porque la duración máxima de la diabetes de 12 semanas utilizada en nuestro estudio puede haber sido demasiado corta para detectar diferencias entre los grupos experimentales. Además, es posible que la luz de adaptación que utilizamos no haya llegado a la retina de la rata debido al cierre de los ojos o a la excavación. Sin embargo, esto es poco probable porque las ratas están activas durante la noche subjetiva, incluso cuando se exponen a una luz de fondo brillante20,21.

El objetivo de nuestro estudio fue evaluar las anomalías neuronales y gliales en la retina en las primeras etapas de la diabetes. No se siguieron los cambios vasculares, que se producen en ratas diabéticas sólo después de muchos meses. Es posible que el protocolo de adaptación a la luz que utilizamos para reducir la hipoxia retiniana haya sido beneficioso para limitar las complicaciones vasculares de la RD, ya que las anomalías vasculares pueden ser causadas por mecanismos diferentes a los de las anomalías neuronales y gliales. Las diferencias entre especies en la PO2 retiniana también complican la interpretación de nuestros resultados. La PO2 retiniana mínima en la oscuridad es menor en primates que en roedores22,23. Por lo tanto, la adaptación a la luz podría tener un efecto mayor en la prevención de la hipoxia en humanos que en ratas.

Se esperaría que la luz de adaptación tenue utilizada en nuestros experimentos reduzca el estrés oxidativo y la producción de radicales libres por parte de los fotorreceptores, lo que puede contribuir al desarrollo de DR24. Sin embargo, nuestro estudio no evaluó el efecto de la fototerapia sobre el estrés oxidativo en la retina.

Nuestros resultados indican que prevenir la adaptación a la oscuridad y, por lo tanto, reducir el consumo de O2 retiniano no frena el desarrollo de anomalías neuronales y gliales tempranas en las retinas de ratas diabéticas. Esto puede ocurrir porque la retina de la rata diabética puede, de hecho, no estar hipóxica25,26. En particular, las mediciones de PO2 intrarretiniana en ratas diabéticas 12 semanas después de la inducción de la diabetes indican un aumento, no una disminución, de la PO227.

Aunque nuestros resultados indican que las anomalías neuronales y gliales inducidas por la diabetes temprana no son causadas por la hipoxia retiniana exacerbada por el consumo de O2 de los bastones, los resultados no descartan la hipótesis de la hipoxia de adaptación oscura de la RD. La validez de esta hipótesis sólo se resolverá mediante experimentación adicional. En última instancia, los ensayos clínicos a gran escala determinarán si la terapia con luz de adaptación tenue es beneficiosa para frenar la progresión de la RD. Actualmente se está realizando uno de estos estudios clínicos28.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados y adheridos a las pautas del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Minnesota (ID de protocolo: 1304-30570A). Ratas macho Sprague-Dawley de dos meses de edad recibieron una única inyección intraperitoneal (ip) de estreptozotocina (STZ; 70 mg/kg disueltos en tampón citrato 0,01 M, pH 4,5) o vehículo solo. La inducción exitosa de la diabetes, definida como un nivel de glucosa en sangre ≥250 mg/dl, se confirmó 3 días después. La glucemia y el peso en ayunas se controlaron semanalmente con un glucómetro OneTouch Ultra (Life Scan, EE. UU.) y, si era necesario, las ratas diabéticas recibieron insulina (Lantus insulina glargina, SANOFI, por vía subcutánea, tres veces por semana) en una dosis subterapéutica de ya sea 1,5 U (rango de glucosa de 250 a 400 mg/dl) o 2,5 U (por encima de 400 mg/dl) para prevenir una pérdida excesiva de peso y una respuesta catabólica.

Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a dos grupos experimentales. Un grupo de animales se alojó bajo un fotociclo de luz y oscuridad de 12:12 con iluminación de 30 lux durante el día y 0 lux durante la noche (iluminación estándar). Un segundo grupo se alojó bajo un fotociclo de luz tenue de 12:12 de 30 lux durante el día y 3 lux durante la noche (iluminación de adaptación tenue). Las condiciones de iluminación tenue se lograron con dos bombillas fluorescentes compactas de 4 vatios (temperatura de color 2700 K). Estas condiciones de alojamiento se introdujeron tres días antes de la inducción de la diabetes y se mantuvieron durante la duración del experimento. Los niveles de luz se midieron con un medidor de iluminancia digital (Easy View Light Meter, ExTech Instruments) en el centro de las jaulas de policarbonato utilizadas para albergar a los animales. Para evitar la adaptación a la oscuridad se utilizó una iluminación nocturna de 3 lux. Esta intensidad corresponde a un nivel de luminancia en el rango mesópico medio29 y se eligió como probablemente inferior a la intensidad que causa daño fototóxico en ratas albinas sanas30. A todas las ratas se les permitió libre acceso a comida y agua.

Además, se utilizaron cinco ratas Sprague-Dawley macho no tratadas (2 meses de edad, con un peso de ~300 g) para evaluar los efectos de la iluminación de fondo en el ERG. Las ratas de este grupo se alojaron en condiciones de iluminación estándar.

Las ratas se mantuvieron en completa oscuridad durante la noche antes de una sesión de registro de ERG. Los preparativos para las grabaciones se realizaron bajo una iluminación roja tenue y fueron seguidos por un período de 20 minutos de oscuridad total para garantizar un estado adaptado a la oscuridad. El ERG flash de campo completo se registró utilizando electrodos de fibra DTL personalizados de ratas anestesiadas con isoflurano (1,5%–2% en 24% O2/76% N2), con un sistema de prueba Espion y un estimulador de campo completo ColorDome LED/Xenon (Diagnosys LLC, Lowell, MA). Las pupilas se dilataron con atropina al 1% (Akorn, Inc. IL) y la superficie corneal se anestesió con proparacaína HCl al 0,5% (Bausch&Lomb,Inc. FL). Los ojos se lubricaron con hipermelosa al 2,5% (Gonivisc, HUB Pharmaceuticals). Después de completar una serie de intensidad escotópica, las respuestas del flash fotópico se registraron en presencia de una luz blanca adaptable (30 cd/m2, unidades fotópicas). Los registros de Flash ERG se filtraron con paso de banda a 0,3 y 500 Hz. Los potenciales oscilatorios se filtraron con paso de banda a 50-200 Hz. Cada registro representa un promedio de 2 a 6 respuestas. Las ratas se sacrificaron inmediatamente después de la medición de ERG y se recogieron los ojos para su evaluación histológica.

Las retinas enteras se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 45 minutos y se congelaron en una mezcla al 50-50% de compuesto OCT (Sakura Tissue-Tek) y Aquamount (Laboratorios Lerner). Se cortaron y montaron secciones de criostato de doce μm de espesor utilizando Vectashield que contenía DAPI (Vector Laboratories). Se tomaron imágenes de las secciones con microscopía confocal (Olympus FluoView 1000), utilizando un objetivo de aceite 20X (UPlan SApo, 0,85 NA) o de aceite 40X (UPlan Fl N, 1,30 NA). Los parámetros de compensación, potencia del láser y ganancia se mantuvieron constantes para las muestras de control y diabéticas.

Para evaluar la gliosis de las células de Müller, se marcaron secciones transversales de la retina con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la glutamina sintetasa (GS), un marcador específico de las células de Müller, utilizando procedimientos modificados de5. La unión no específica se bloqueó con suero de burro normal al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de tejido se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados C (GFAP, 1:500, anti-GFAP de cabra, Santa Cruz y GS, anti-GS de ratón 1:200, BD Biosciences) y anticuerpos secundarios (1:500, anti-GS de burro, -ratón Alexa Fluor 647 y burro anti-cabra Alexa Fluor 488; Molecular Probes) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se contó el porcentaje de procesos de células de Müller GS positivas en la capa plexiforme interna que fueron coetiquetadas para GFAP. Para cada sección, se realizaron mediciones en tres regiones de la retina con una separación de aproximadamente 800 micrones, una cerca del disco óptico (central), una segunda en la retina media y una tercera en la periferia. Todas las inmunotinciones se repitieron dos veces. La tinción que omitió el anticuerpo primario sirvió como control negativo.

El espesor total en la región central de la retina se evaluó en secciones criostáticas teñidas con DAPI que cruzaban el disco óptico. Aunque los artefactos histológicos como la deshidratación y la contracción pueden contribuir a cambios en la estructura de las secciones histológicas, estos procesos afectarán la medición del espesor de la retina por igual en todos los grupos experimentales.

Se tomaron imágenes de células apoptóticas con etiquetado TUNEL utilizando el kit de detección de muerte celular in situ, fluoresceína (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el proveedor. Brevemente, las secciones fijadas se permeabilizaron en PBS que contenía Triton X-100 (Sigma) y luego se incubaron en la mezcla de reacción durante 60 minutos a 37 grados C. Las células TUNEL positivas se contaron manualmente en cada una de las dos secciones que recorrían el disco óptico y se analizaron. como el número de células positivas por longitud de la sección de retina.

Los valores experimentales se informan como media ± sem. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism. Se utilizó ANOVA de medidas estándar y repetidas para comparar grupos experimentales en distintos momentos y condiciones de vivienda. Se realizaron comparaciones múltiples post hoc cuando fue apropiado utilizando el método de Tukey. Se utilizó la prueba t bilateral para determinar las diferencias por pares. Todos los análisis se realizaron con significancia en P <0,05.

Cómo citar este artículo: Kur, J. et al. La adaptación a la luz no previene las anomalías tempranas de la retina en ratas diabéticas. Ciencia. Rep. 6, 21075; doi: 10.1038/srep21075 (2016).

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Este trabajo fue apoyado por NIH R21-EY023216 y NIH P30-EY011374. Los autores agradecen a Robert Miller, Kyle Biesecker y Anja Srienc por sus comentarios sobre el manuscrito, y a Heidi Roehrich por su excelente asistencia técnica.

Michael A. Burian

Dirección actual: Dirección actual: Departamento de Salud de Minnesota, Saint Paul, MN, EE. UU.,

Departamento de Neurociencia, Universidad de Minnesota, MN 55455, Minneapolis, EE. UU.

Joanna Kur, Michael A. Burian y Eric A. Newman

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EAN concibió el estudio. JK y EAN diseñaron los experimentos y escribieron el manuscrito; JK realizó los experimentos y analizó los resultados. MAB contribuyó a establecer el modelo STZ. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Eric A. Newman.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

Este trabajo está bajo una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; Si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Reimpresiones y permisos

Kur, J., Burian, M. y Newman, E. La adaptación a la luz no previene las anomalías tempranas de la retina en ratas diabéticas. Representante científico 6, 21075 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21075

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Recibido: 07 de septiembre de 2015

Aceptado: 18 de enero de 2016

Publicado: 08 de febrero de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21075

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