Los aminolípidos provocan un comercio funcional

The ISME Journal volumen 17, páginas 315–325 (2023)Cite este artículo

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Los lípidos desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad celular y la homeostasis con el entorno circundante. Las bacterias cosmopolitas del clado roseobacter marino (MRC) y del clado SAR11 son únicas porque, además de glicerofosfolípidos, también producen una variedad de lípidos que contienen aminoácidos que se conjugan con ácidos grasos beta-hidroxi a través de un enlace amida. Dos de estos aminolípidos, el aminolípido ornitina (OL) y el aminolípido glutamina (QL), se sintetizan utilizando la O-acetiltransferasa OlsA. Aquí, demostramos que OL y QL están presentes en las membranas interna y externa de la bacteria Gram-negativa MRC Ruegeria pomeroyi DSS-3. En un mutante olsA, la pérdida de estos aminolípidos se compensa con un aumento simultáneo de glicerofosfolípidos. La incapacidad de producir aminolípidos provocó cambios significativos en el proteoma de la membrana: la membrana era menos permeable y los transportadores de nutrientes clave estaban regulados a la baja, mientras que las proteínas implicadas en la respuesta al estrés de la membrana estaban reguladas al alza. De hecho, la importación de colina marcada con 14C y dimetilsulfoniopropionato, como sustituto del transporte de nutrientes marinos clave a través de las membranas, se vio significativamente afectada en el mutante olsA. Además, el mutante olsA era significativamente menos competitivo que el tipo salvaje (WT) y no podía competir con la cepa WT en cocultivo. Sin embargo, el mutante olsA incapaz de sintetizar estos aminolípidos es menos susceptible a la unión de fagos. En conjunto, estos datos revelan un papel crítico de los aminolípidos en la ecofisiología de este importante clado de bacterias marinas y un equilibrio entre el crecimiento y la evitación de la unión de bacteriófagos.

Los lípidos de membrana forman la base estructural de una célula que separa los compartimentos intracelulares y los componentes celulares del entorno externo. El glicerol forma la columna vertebral de la síntesis de glicerofosfolípidos en bacterias, arqueas y eucariotas, y gran parte de nuestro conocimiento sobre los lípidos de membrana, incluida la síntesis, la bioquímica y la biofísica de la bicapa lipídica, proviene de estudios extensos en unos pocos organismos modelo (p. ej., Escherichia coli ). Durante mucho tiempo se ha argumentado que la evolución seleccionó el uso de glicerofosfolípidos en la membrana del último ancestro común en la evolución temprana de las células y, de hecho, los glicerofosfolípidos son ubicuos en todas las formas de vida [1, 2].

Un grupo de lípidos importante pero poco estudiado son los aminolípidos que contienen aminoácidos. Trabajos recientes han demostrado que los aminolípidos son particularmente abundantes en bacterias heterótrofas marinas cosmopolitas de importancia ecológica. Utilizando las bacterias marinas del clado Roseobacter (MRC) como modelo, hemos demostrado previamente que los aminolípidos que contienen ornitina (OL) y glutamina (QL) son comunes en este grupo bacteriano [3, 4]. La biosíntesis de estos lípidos se lleva a cabo mediante dos enzimas distintas, una N-acetiltransferasa responsable de la conjugación inicial del aminoácido correspondiente (es decir, glutamina u ornitina) con un ácido graso beta hidroxi y una O-acetiltransferasa responsable de la conjugación de un segundo ácido graso del lisolípido. En el modelo de la bacteria del clado roseobacter marino Ruegeria pomeroyi DSS-3, la biosíntesis de OL y QL está mediada por OlsB y GlsB seguida de O-acetilación por la proteína OlsA [4]. La biosíntesis de OL en algunas bacterias como Vibrio y Serratia también puede estar mediada por una proteína de fusión llamada OlsF que contiene un dominio tipo OlsB en el extremo N y un dominio tipo OlsA en el extremo C [5, 6]. Recientemente se han documentado varios otros aminolípidos, incluidos los aminolípidos que contienen glicina y lisina en Bacteroidetes y Pseudopedobacter y un aminolípido que contiene sulfonato en roseobacter, respectivamente [7,8,9].

El papel fisiológico de estos lípidos que contienen aminoácidos sigue sin caracterizarse en gran medida. Nosotros y otros hemos demostrado que los aminolípidos como OL y QL son comunes en una variedad de bacterias marinas y se sintetizan como lípidos sustitutos para reemplazar los glicerofosfolípidos en respuesta a la limitación de fósforo (P), aunque en las cepas MRC, pero no en las SAR11, estos aminolípidos son constitutivamente expresado [4, 10,11,12,13]. De hecho, muchas bacterias producen OL constitutivamente, independientemente de la concentración de P disponible [14]. OL parece afectar la cantidad de citocromos en las membranas de Rhodobacter capsulatus [11]. En Sinorhizobium meliloti, la OL se produce en exceso en respuesta al estrés por fósforo, aunque no desempeña un papel en la nodulación [12]. Recientemente, se ha demostrado que la sobreproducción de OL aumenta la resistencia de Pseudomonas aeruginosa a los antimicrobianos catiónicos [15]. El papel de la calidad de vida se comprende menos. QL parece estar restringido al clado marino roseobacter y bacterias estrechamente relacionadas en la familia Rhodobacteraceae y parece intercambiable con OL [4].

En este estudio, nos propusimos investigar la ubicación de los aminolípidos y su función fisiológica en la membrana de Ruegeria pomeroyi DSS-3. Utilizando lipidómica y proteómica comparadas, también buscamos comprender cómo la pérdida de los aminolípidos OL y QL afectó los perfiles lipídicos y proteicos de las membranas interna y externa y la capacidad de transporte de la membrana, comparando la cepa de tipo salvaje (WT) con un mutante olsA deficiente en ambos OL. y QL [4]. Demostramos un papel crítico para estos aminolípidos en la membrana de esta bacteria con el mutante olsA mostrando un defecto considerable en la abundancia y funcionalidad de los transportadores de membrana necesarios para su crecimiento óptimo. Sin embargo, parece haber una compensación por la cual la cepa con deficiencia de aminolípidos es menos susceptible a la unión de fagos en comparación con el tipo salvaje. Por tanto, la bacteria parece equilibrar finamente la producción de estos lípidos en un equilibrio entre un crecimiento óptimo y evitar la unión de fagos.

Todas las bacterias marinas utilizadas en este estudio se cultivaron utilizando el medio ½ YTSS (levadura-triptona-sal marina) (DSMZ 974), que contiene extracto de levadura 2 g/L, triptona 1,25 g/L y sales marinas Sigma 20 g/L o el medio definido de sal mineral de amonio marino (MAMS) (DSMZ 1313) donde HEPES (10 mM, pH 8,0) reemplazó el tampón fosfato [16]. Todos los cultivos se cultivaron a 30 °C aeróbicamente en un agitador (150 rpm).

Para los ensayos de competencia de crecimiento entre el mutante WT y olsA, se cultivaron cultivos de bacterias en 10 ml de medio YTSS ½ para la cepa WT, o con la adición de 10 µg/ml de gentamicina para el mutante olsA, ya que se insertó un casete de gentamicina para construir el mutante [4]. Las células se recogieron en la fase exponencial media tardía y se diluyeron hasta una densidad óptica medida a 540 nm (OD540) de 1,0. Luego, estas células se inocularon al 1% (v/v) en matraces de 250 ml que contenían 50 ml de medio de crecimiento (ya sea ½ YTSS o MAMS + Pi 0,5 mM) por triplicado y se cultivaron a 30 °C con agitación a 140 rpm. En el momento 0 h, se retiraron muestras de 100 µL por triplicado de cada matraz. Luego, estas muestras se diluyeron en serie diez veces en el mismo medio de crecimiento hasta una dilución de 10-9. De cada tubo de dilución en serie, se pipetearon gotas de 10 µL por triplicado en placas de agar que contenían ½ agar YTSS (para contar tanto el WT como el mutante olsA) o ½ agar YTSS + 10 µg/ml de gentamicina (para contar solo el mutante olsA). . Una vez secas las gotas, las placas se incubaron a 30 °C durante 3-4 días. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se determinaron contando el número de colonias en el número de dilución donde las colonias individuales eran claramente visibles. Para los cultivos cultivados en medio ½ YTSS, las muestras se retiraron y enumeraron utilizando el mismo método en los momentos de 24 h y 96 h. Para los cultivos cultivados en medio MAMS + Pi 0,5 mM, las muestras se retiraron y enumeraron en los puntos temporales 0 h, 48 h y 96 h.

La cepa WT y el mutante olsA se cultivaron en ½ medio YTSS hasta una DO540 ~0,8. Luego se recogió un litro de cultivo mediante centrifugación a 12.300 x g a 4 °C durante 10 minutos, utilizando un rotor JLA 10,5. Las células se lavaron y se resuspendieron en 50 ml de tampón HEPES (pH 8,0, 10 mM). Luego, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4500 x g a 4 °C durante 10 minutos, antes de resuspender el sedimento en 3 ml de tampón HEPES (pH 8,0, 10 mM), que contenía un cóctel inhibidor de proteasa completo 1,6X (Roche) y un tampón ADNasa I 3X. (NEB) y 6 unidades/mL de ADNasa I (NEB). Luego se lisaron las células usando una prensa francesa a 1000 PSI. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 4.500 x g a 4 °C durante 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga Oakridge para sedimentar las membranas totales mediante centrifugación a 75.600 x g a 10 °C durante 45 minutos en un JA25.5. rotor. Luego se lavaron las membranas granuladas y se resuspendieron en sacarosa al 20% (p/v) en tampón HEPES (10 mM, pH 8,0). Luego, las muestras de membrana resuspendidas se colocaron en capas encima de un gradiente gradual que contenía 3,3 ml de sacarosa al 73 % (p/v) en el fondo y 6,7 ml de sacarosa al 53 % (p/v) en el medio. Las membranas interna (IM) y externa (OM) se separaron mediante centrifugación a 140.000 x g a 4 ° C, durante 16 horas en un rotor SW40-Ti. El IM residía en la interfaz entre las capas de sacarosa de 53% (p/v) y 20% (p/v) y el OM en la interfaz entre las capas de sacarosa de 53% (p/v) y 73% (p/v). . Tanto las muestras IM como OM se retiraron de la interfaz de densidad de sacarosa, se diluyeron con 30 ml de tampón HEPES (10 mM, pH 8,0) y se sedimentaron mediante centrifugación a 75.600 x g durante 45 minutos. Luego se resuspendieron IM y OM en 1 ml del mismo tampón HEPES antes de las extracciones de lípidos y proteínas.

Las muestras IM y OM se disolvieron cuidadosamente en 100 μl de tampón de carga 1X LDS (Invitrogen) antes de cargarlas en un gel Tris-Bis NuPAGE prefabricado (Invitrogen) usando una solución de ejecución 1X MOPS (Invitrogen). La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS se realizó durante aproximadamente 5 minutos para purificar los polipéptidos en el gel de poliacrilamida mediante la eliminación de contaminantes. Se cortaron bandas de gel de poliacrilamida que contenían el proteoma de membrana y se digirieron mediante proteólisis con tripsina (Roche). Los péptidos trípticos resultantes se extrajeron usando ácido fórmico-acetonitrilo (5%:25%, v/v) antes de la resuspensión en acetonitrilo-trifluoroacetato (2,5%:0,05%, v/v). Los péptidos trípticos se separaron mediante cromatografía nanolíquida (nanoLC) utilizando un sistema Ultimate 3000 LC con una columna de fase inversa Acclaim PepMap RSLC C18 (ThermoFisher) en la Plataforma Tecnológica de Investigación en Proteómica (PRTP) de la Universidad de Warwick. Los espectros MS/MS se recogieron utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (ThermoFisher) en modo de ionización por electropulverización (ESI). Se recogieron escaneos de encuesta de péptidos de m/z 350 a 1500 para cada muestra en una serie de LC-MS de 1,5 horas. Esto dio como resultado 12 espectros de masas (3 réplicas biológicas de IM y OM de WT y el mutante olsA) con un total de ~ 7,5 G de datos de MS/MS.

Se buscaron archivos sin formato MS/MS compilados con el genoma de Ruegeria pomeroyi DSS-3 utilizando el paquete de software MaxQuant [17, 18]. Se utilizaron configuraciones predeterminadas y las muestras se compararon entre ejecuciones. El paquete de software Perseus (v1.6.5.0) se utilizó para determinar proteínas expresadas diferencialmente con una tasa de descubrimiento falso (FDR) de 0,01 [19]. La intensidad LFQ (cuantificación sin etiquetas) de cada proteína se normalizó dividiendo la intensidad total de péptidos de cada muestra por la longitud de cada proteína. Los péptidos se conservaron para análisis adicionales solo si se encontraron consistentemente en las tres réplicas biológicas en al menos un conjunto de las cuatro muestras (IM_WT, IM_olsA, OM_WT, OM_olsA). Los valores faltantes se imputaron utilizando los parámetros predeterminados (ancho, 0,3; cambio descendente 1,8) y los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba t de Student para dos muestras. Los gráficos de análisis de componentes principales (PCA) y los gráficos de volcanes se generaron utilizando la configuración predeterminada en el paquete Perseus.

Para analizar las vías de las proteínas expresadas diferencialmente entre las de tipo salvaje y las mutantes, se anotaron las secuencias de aquellas proteínas que estaban significativamente sobrerrepresentadas (FDR <0,01) en cada muestra utilizando el programa BlastKOALA en el servidor de mapeo de vías de KEGG (https:/ /www.kegg.jp/blastkoala/) utilizando la siguiente configuración (grupo de taxonomía-Prokaryotes; bases de datos de genes KEGG- family_eukaryotes + genus_prokaryotes).

La extracción de lípidos de cultivos bacterianos se llevó a cabo utilizando el protocolo de extracción de Folch modificado como se describió anteriormente [20]. Antes de la extracción de lípidos de las muestras IM y OM, se les añadió esfingosilfosfoetanolamina (SPE) d17:1/12:0 hasta una concentración final de 500 nM. Luego se extrajeron los lípidos totales usando metanol-cloroformo, se secaron bajo gas nitrógeno y el precipitado se resuspendió en acetonitrilo: acetato de amonio 10 mM a 95:5 (v/v). Luego, los lípidos se analizaron mediante LC-MS utilizando un HPLC Dionex 3400RS con una columna HILIC BEH amide XP (Waters) acoplada con una trampa de iones amaZon SL MS (Bruker) mediante ionización por electropulverización. Después de ejecutar en LC-MS, las intensidades de cada pico de muestra se calcularon utilizando el programa Bruker QuantAnalysis y se compararon con la intensidad de SPE. Utilizando la concentración conocida de SPE, estas intensidades se compararon con curvas de calibración externas creadas previamente (Figura complementaria S2) para cada especie de lípidos, incluidos PG y PE. Cuando no había una curva de calibración disponible debido a la falta de material de referencia auténtico para una especie de lípido en particular, las intensidades se compararon con curvas para especies de lípidos que eran estructuralmente similares (p. ej., PE para OL, QL, MMPE, DMPE y lisoPE). Utilizando esta información, se podría calcular la abundancia relativa de la proporción molar de las especies de lípidos en cada fracción de membrana.

Se cultivaron colonias individuales de R. pomeroyi DSS-3 en ½ YTSS durante la noche a 30 °C con agitación (160 rpm). Se inoculó ½ YTSS fresco en una proporción del 2 % (v/v) y se cultivó en placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejidos (Falcon) en presencia de una dilución seriada al doble de una serie de productos químicos antimicrobianos. Las placas se incubaron a 30 °C con agitación (150 rpm) y se tomaron lecturas del punto final a A540 nm a las 24 o 48 h en un lector de placas Fluostar Omega (BMG Labtech).

Para medir la permeabilidad de la membrana, se controló la absorción de cristal violeta utilizando un método publicado previamente [21]. Brevemente, las células se cultivaron hasta una DO540 de 0,5 a 0,6 y se extrajeron muestras de 1 ml para su análisis. Se preparó una solución de cristal violeta en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a 10 µg/ml y se midió la DO590. Las células se lavaron mediante centrifugación a 4500 x g durante 10 minutos, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en el mismo volumen de tampón PBS (pH 7,4). El paso de lavado se repitió dos veces antes de resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS + cristal violeta (10 µg/ml). Luego las suspensiones celulares se incubaron a 30 °C durante 10 min. Después de esto, las células se recogieron mediante centrifugación a 13.400 x g durante 15 minutos, el sobrenadante se retiró a una cubeta de 1 ml y se midió la DO590. Para medir el porcentaje de absorción de cristal violeta, se utilizó la siguiente ecuación:

La absorción de N-fenil-1-naftilamina (NPN) se midió como se describió anteriormente [22]. Brevemente, los cultivos se cultivaron en medio ½YTSS a 30 °C hasta una DO540 de ~ 0,5. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 3000 x g y temperatura ambiente, antes de resuspenderlas en la mitad del volumen de HEPES 5 mM, pH 8,0. Los reactivos se agregaron por triplicado a una microplaca de 96 pocillos Greiner Bio-One Black de la siguiente manera: (1) 200 µl de HEPES; (2) 100 µl de HEPES + 100 µl de bacterias; (3) 150 µl de HEPES + 50 µl de NPN (40 µM); (4) 50 µL de HEPES + 50 µL de bacterias + 50 µL de NPN (40 µM). Todos los componentes, excepto las bacterias, se agregaron a los pocillos con anticipación, luego las bacterias se agregaron inmediatamente antes de la medición y los valores de fluorescencia comenzaron a registrarse en 1 minuto. La fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas BMG Labtech Fluostar Omega, con filtros configurados para excitación a 355 nm y emisión a 460 nm. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente. Las muestras se midieron en modo placa cada 30 segundos durante 10 minutos en total.

La hidrofobicidad celular se midió utilizando un método publicado previamente [15]. Brevemente, las células se cultivaron en medio ½ YTSS hasta una DO540 de 0,5 a 0,6. A una muestra de células de 1,2 ml, se agregaron 200 µl de hexano y las muestras se mezclaron durante 1 min. Después de esperar de 5 a 10 minutos para permitir la separación de fases, la fase acuosa inferior se retiró a una cubeta de 1 ml y se midió la DO540. El porcentaje de adhesión de las células a la fase orgánica se calculó de la siguiente manera:

\({{{{{{{\mathrm{Hidrofobicidad}}}}}}}} = \frac{{({{{{{{{\mathrm{OD}}}}}}}}_{540} \;{{{{{{{\mathrm{de}}}}}}}}\;{{{{{{{\mathrm{el}}}}}}}}\;{{{{{{ {\mathrm{inicial}}}}}}}}\;{{{{{{\mathrm{bacteriana}}}}}}}}}\;{{{{{{\mathrm{suspensión}} } }}}}} - {{{{{{{\mathrm{OD}}}}}}}}_{540}\;{{{{{{\mathrm{de}}}}}}}} } \;{{{{{{\mathrm{el}}}}}}}}\;{{{{{{{\mathrm{acuoso}}}}}}}}\;{{{{{ {{{ {\mathrm{fase}}}}}}}})}}{{{{{{{\mathrm{OD}}}}}}}}_{540}\;{{{{{ {{ \mathrm{de}}}}}}}}\;{{{{{{\mathrm{el}}}}}}}}\;{{{{{{{\mathrm{inicial}} }} }}}}\;{{{{{{\mathrm{bacteriana}}}}}}}}\;{{{{{{{\mathrm{suspensión}}}}}}}}} }}} \veces 100\)

El dimetilsulfoniopropionato marcado con 14C ([1-14C]-DMSP) se sintetizó a partir de sulfuro de dimetilo y ácido acrílico marcado con 14C como se describe en otro lugar [23]. Para determinar la concentración radiactiva, se añadió 1 μl de 14C-DMSP sintetizado a 3 ml de líquido de centelleo (EcoLume Liquid Scintillation Cocktail, MP Biomedicals) y se midió en un analizador de centelleo líquido (Tri-Carb 2800TR, PerkinElmer) después del equilibrio durante la noche. La concentración radiactiva de 14C-DMSP se midió de forma independiente tres veces y se encontró que la actividad era de 0,448 kBq μL-1. La identidad y la concentración molar de DMSP se determinaron mediante LC-MS de acuerdo con un método publicado previamente [24]. Se añadió 14C-DMSP en metanol:cloroformo:agua (12:5:1, v/v) con 200 nM de glicina betaína deuterada (d11-GBT, adquirida de Cambridge Isotope Laboratories Inc.) como estándar interno (ISTD). Las muestras se separaron en una columna Discovery HS F5 (Supelco) con una columna protectora (HS F5 Supelguard) (ambas obtenidas de Sigma-Aldrich) usando una HPLC Dionex 3400RS y las masas se detectaron usando una trampa de iones amaZon SL MS (Bruker) mediante ESI en positivo. Modo iónico. Las áreas de pico de DMSP se detectaron a m/z 135 y de ISTD a m/z 129 y se determinaron en cada muestra utilizando el software Bruker QuantAnalysis. La relación del área del pico de DMSP:ISTD para cada muestra se comparó con una curva de calibración (Figura complementaria S3). Por lo tanto, se enriquecieron estándares de DMSP por triplicado (clorhidrato de dimetilpropiotetina, Supelco vía Merck) que cubrían un rango de concentración de 0,005 a 2 μM en metanol:cloroformo:agua (12:5:1, v/v) con d11-GBT 200 nM, se midieron y áreas de pico determinadas como se describe anteriormente. La relación de DMSP a ISTD permitió cuantificar la concentración molar de DMSP en el stock de 14C-DMSP, que fue de 328,8 ± 15,2 mM.

Se inoculó una única colonia del mutante WT y olsA en 5 ml de caldo marino 2216 (MB), y se cultivó durante aproximadamente 24 h a 30 °C con agitación (170 rpm). Para el crecimiento en ½ YTSS, las células se sedimentaron mediante centrifugación (1000 xg, 3 min), se lavaron dos veces en ½ YTSS y se inocularon en 50 ml de medio ½ YTSS en una proporción del 1 % (v/v). Las células se cultivaron durante 4 h a 30 °C con agitación (170 rpm) hasta que se alcanzó una DO540 de ~0,2 y se usaron para el ensayo de absorción de colina. Para el crecimiento en medio MAMS con Pi 2 mM, las células se sedimentaron mediante centrifugación (1000 xg, 3 min), se lavaron dos veces en medio MAMS con Pi 2 mM y se inocularon en una proporción del 1 % (v/v) en 50 ml de MAMS con 2 mM. mMPi. Las células se cultivaron durante 5 días a 30 °C con agitación, luego se sedimentaron mediante centrifugación (1000 x g, 3 min), se lavaron una vez en MAMS con Pi 2 mM y se inocularon en una proporción del 1 % (v/v) en 50 ml de MAMS fresco. con Pi de 2 mm. Para el crecimiento en medio MAMS con Pi 0,5 mM, las células se sedimentaron, se lavaron y se cultivaron previamente en MAMS con Pi 2 mM como se describe anteriormente. Luego, las células se sedimentaron mediante centrifugación (2000 x g, 3 min) y se lavaron una vez en medio MAMS con Pi 0,5 mM. Se inocularon células WT en una proporción del 1% y células mutantes olsA en una proporción del 10% (v/v) en 50 ml de MAMS fresco con Pi 0,5 mM. Los cultivos se cultivaron hasta alcanzar una DO540 de 0,2 a 0,4 y luego se utilizaron para el ensayo de absorción de colina.

Para los ensayos de absorción utilizando [metil-14C] colina (55,2 mCi mmol-1, Perkin Elmer), las células se diluyeron 1:1 (v/v) en el mismo medio fresco y 8 concentraciones (0,5–25 µM) de colina (14C). :12C a 1:1000, v/v) a 5 ml de cultivo de tres réplicas biológicas. Las células se incubaron a 30 °C con agitación (130 rpm) durante 5 minutos, se recogieron mediante filtración en filtros Supor de tamaño de poro de 0,2 µm (∅ 25 mm de diámetro, Pall Corporation) y los filtros se lavaron 3 veces con 1 ml del medio correspondiente. Los filtros se transfirieron a viales de centelleo de 6 ml, se cubrieron con 3 ml de líquido de centelleo (EcoLume Liquid Scintillation Cocktail, MP Biomedicals) y se midieron en un analizador de centelleo líquido (Tri-Carb 2800TR, PerkinElmer) después del equilibrio durante la noche. Para la corrección de fondo, las células se fijaron en una concentración final de solución de paraformaldehído al 2% (v/v) durante un mínimo de 15 minutos a 4 °C en la oscuridad antes de la adición del radioisótopo. La velocidad máxima de absorción (Vmax) y la constante de Michaelis (Km) se calcularon según la transformación de Lineweaver-Burke.

Para los ensayos de absorción de DMSP, el mutante WT y olsA se cultivaron durante aproximadamente 24 h a 30 °C con agitación (170 rpm) antes de inocular en una proporción de 1 % v/v en 50 ml de caldo marino fresco. Las células se cultivaron hasta alcanzar una DO540 de ~0,5–0,8 antes de realizar el ensayo de absorción de DMSP. La concentración radioquímica relativamente baja del stock de 14C-DMSP (0,448 kBq μL-1, 329 mM) hizo poco práctico utilizar menos de 50 μM de stock de DMSP para los ensayos cinéticos de absorción, ya que la radioactividad estaría por debajo del límite de detección del analizador de centelleo. (Tri-Carb 2800TR, PerkinElmer). Por lo tanto, se agregaron tres concentraciones altas de DMSP (50, 150 y 300 µM) a 3 ml de cultivo sin diluir de tres réplicas biológicas. Las células se incubaron y procesaron como se describió anteriormente y los recuentos de 14C-DMSP para cultivos mutantes WT y olsA se midieron en el contador de centelleo.

Para normalizar las tasas de absorción, los recuentos de células bacterianas se determinaron mediante citometría de flujo como se describió anteriormente [25]. Se fijaron submuestras de 1 ml de cada cultivo con glutaraldehído (grado de microscopía electrónica, BDH) (concentración final del 0,5% (v/v)) durante 30 minutos a 4 °C, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Las muestras se fundieron durante 5 minutos a 37 °C y se tiñeron con oro SYBR (Invitrogen) (concentración final 10-4 de stock comercial) durante 10 minutos a 60 °C en la oscuridad. Las muestras se diluyeron entre 10 y 50 veces (colina) y entre 100 y 200 veces (DMSP) en tampón TE estéril (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). Se contaron tres réplicas analíticas de cada muestra en un citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter) equipado con un láser de diodo de estado sólido de 50 mW y 488 nm y filtros estándar a un caudal de 30 µL min-1 durante 60 s con el discriminador configurado en 525 nm (fluorescencia verde).

Para determinar el impacto del mutante olsA en la interacción de la bacteria con los bacteriófagos, se comparó la tasa de adsorción (k) del bacteriófago al R. pomeroyi DSS-3 WT y al mutante olsA. En este experimento se utilizó el bacteriófago DSS3Phi2, el primer bacteriófago conocido que infecta a R. pomeroyi DSS-3 [26]. Brevemente, los matraces de cultivo que contenían 9 ml de células bacterianas con una DO540 de 0,5 se mantuvieron en un baño de agua a 30 °C, con otro matraz que contenía 9 ml de medio YTSS ½ como control. Después de permitir que la temperatura de los matraces se equilibrara, se añadió DSS3Phi2 a los matraces a una MOI de 0,1, momento en el que se inició un cronómetro. En los momentos de 0, 2, 5, 10, 20 y 30 minutos después de la infección, se retiraron 100 µL de bacterias de cada matraz y se agregaron a un tubo Eppendorf que contenía 890 µL de medio YTSS ½ y 10 µL de cloroformo, y se mantuvieron en hielo. . Después de tomar el punto de tiempo final, todas las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 2000 × g y 4 ° C para sedimentar las células bacterianas y el fago adsorbido. Luego se eliminó el sobrenadante en un tubo Eppendorf nuevo y se mantuvo a 4 °C. Para determinar el título de fagos, se eliminaron 100 µl de sobrenadante y se diluyeron en serie en tubos Eppendorf que contenían 900 µl de medio YTSS ½ hasta 10-9. Se retiraron 900 µl de las diluciones 10-4 a 10-9 y se agregaron a una placa de 6 pocillos. A cada pocillo, se añadió 1 ml de cultivo huésped (R. pomeroyi DSS-3 de tipo salvaje) a una DO540 de aproximadamente 0,3, así como 4 ml de agar ½ YTSS blando (0,8% p/v). Las placas se dejaron secar antes de incubarlas durante la noche a 30 °C. Al día siguiente, se contaron visualmente los pocillos que contenían entre 10 y 100 placas y se utilizaron para calcular el título inicial de fagos. La constante de adsorción de fagos se calculó utilizando la siguiente ecuación ln(P/P0) = - kNt donde P es el título de fagos libres después de la adsorción, P0 es el título total de bacteriófagos, k es la constante de adsorción (ml/min), N es la densidad bacteriana (células/ml) y t es el tiempo (min) [27].

Para determinar la ubicación de QL y OL, utilizamos un gradiente de densidad de sacarosa paso a paso para separar la membrana interna (IM) y la membrana externa (OM) del mutante Ruegeria pomeroyi DSS-3 WT y olsA cultivadas en medio YTSS. El IM se encontró consistentemente en la interfaz entre el 20-53% (p/v) de sacarosa, mientras que el OM estaba en la interfaz entre los pasos de 53-73% (p/v) de sacarosa (Fig. 1A). Para determinar la ubicación de los aminolípidos en la membrana, se extrajeron lípidos de membrana intactos tanto de IM como de OM de la cepa WT y se analizaron mediante espectrometría de masas con cromatografía líquida (LC-MS). Además de los glicerofosfolípidos comúnmente observados, fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidiletanolamina (PE), esta bacteria también produjo varios fosfolípidos menos abundantes, incluidos monometil-PE (MMPE), dimetil-PE (DMPE) y liso-PE, así como el aminolípidos OL y QL (Fig. 1B). Aunque los aminolípidos QL y OL se encontraron tanto en IM como en OM, QL fue más abundante en OM que en IM.

A Separación de las membranas en gradiente de densidad de sacarosa. B Análisis lipidómicos de los lípidos de las membranas interna y externa en el mutante WT y olsA. PG fosfatidilglicerol, PE fosfatidiletanolamina, MMPE monometilfosfatidiletanolamina, DMPE dimetilfosfatidiletanolamina, lisoPE lisofosfatidiletanolamina, aminolípido que contiene ornitina OL, aminolípido que contiene glutamina QL, aminolípido que contiene sulfonato SAL.

Para determinar el impacto de una eliminación de olsA en el perfil lipídico de la membrana, comparamos los perfiles lipídicos entre la cepa WT y el mutante (Fig. 1B). Todos los fosfolípidos se encontraron en el mutante, pero los aminolípidos OL y QL estaban ausentes en el mutante olsA debido a la naturaleza esencial de olsA en el paso final de la biosíntesis de QL/OL [4]. El PG es, con diferencia, el lípido más abundante en esta bacteria. En el IM, el PG representó ~60% en el WT y ~80% en el mutante. De manera similar, en el OM, el PG aumentó de ~45% en el WT a ~65% en el mutante. En conjunto, los datos de lipidómica sugieren que la falta de aminolípidos OL/QL tanto en IM como en OM en el mutante olsA se compensa principalmente con un aumento concomitante en el fosfolípido PG.

Determinamos si la incapacidad para sintetizar aminolípidos provocaba una alteración en las propiedades de la membrana. La eliminación de los aminolípidos OL/QL alteró significativamente la hidrofobicidad de la membrana (Fig. 2A), aunque queda por establecer si esto se debe a la pérdida directa de aminolípidos en el OM o a una consecuencia en cadena de la alteración en el proteoma del OM (ver abajo). El mutante olsA mostró una permeabilidad significativamente reducida según lo determinado por ensayos de absorción que utilizan cristal violeta (que penetra la OM pero no la IM citoplasmática [28]), N-fenil-1-naftilamina (NPN) que mide la permeabilidad de la OM (Fig. 2B, C , F) y eosina Y (Figura complementaria S1). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que un cambio tan dramático en las propiedades de la membrana podría tener consecuencias inesperadas en el crecimiento del mutante. Por lo tanto, comparamos las tasas de crecimiento del mutante WT y olsA en dos tipos diferentes de medios, un medio rico en nutrientes (½ YTSS) y un medio sintético definido (MAMS). En medio ½ YTSS, aunque la tasa de crecimiento de las dos cepas fue comparable cuando se cultivaron de forma independiente (Tabla 1), la cepa WT superó claramente al mutante olsA después de 24 h en cocultivo (Fig. 2D). A las 48 h, el WT era ~9 veces más abundante que el mutante. La competitividad de la cepa WT fue aún más pronunciada en el medio MAMS sintético definido. Por lo tanto, la tasa de crecimiento del mutante fue solo la mitad de la del WT en MAMS que contenía Pi 2 mM y tuvo problemas para crecer a Pi 0,5 mM y 0,1 mM en medio MAMS (Tabla 1). Como se esperaba, en el cocultivo con el WT, el mutante fue claramente superado después de 48 h, momento en el que el WT era ~ 20 veces más abundante que el mutante (Fig. 2E). Estos resultados, por tanto, sugieren que la incapacidad de sintetizar los aminolípidos QL/OL representa una desventaja importante para la competitividad de esta bacteria.

La mutación de olsA cultivada en el medio ½ YTSS causó cambios significativos en las propiedades de la membrana, incluida la hidrofobicidad (A), la permeabilidad de la membrana usando el ensayo de absorción violenta de cristales (paneles B y F) y el ensayo de absorción de N-fenil-1-naftilamina (NPN) (panel C). El mutante olsA es menos competitivo y superado (paneles D y E) por el WT en cocultivo en medio caldo rico en nutrientes (1/2 YTSS) y un medio sintético definido (MAMS, Pi 0,5 mM, glucosa 10 mM), respectivamente. .

Para obtener información mecanicista sobre la ventaja competitiva de la cepa WT sobre el mutante olsA, analizamos los perfiles de proteínas IM y OM utilizando proteómica comparativa (ver Fig. 3A, B). El análisis de componentes principales (PCA) mostró una clara separación de las muestras IM y OM entre las cepas mutantes WT y olsA, y el tipo de membrana explica el 77% de la diferencia (Fig. 3C). La eliminación del gen olsA explicó solo el 11% de la diferencia total según el análisis PCA, lo que sugiere que la diferencia en el proteoma se debe principalmente al tipo de membrana.

SDS-PAGE de proteínas de la membrana interna (A) y proteínas de la membrana externa (B) del mutante WT y olsA. M, marcador de peso molecular de proteínas. La separación de membranas se llevó a cabo en tres réplicas biológicas. C Análisis de componentes principales (PCA) que muestra que el tipo de membrana es el factor clave para la separación. D Proteínas expresadas diferencialmente en la membrana interna (IM) entre el WT y el mutante olsA, límite de FDR 0,01. E Proteínas expresadas diferencialmente en la membrana externa (OM) entre el WT y el mutante olsA, límite de FDR 0,01. Las proteínas que están reguladas al alza en el WT se muestran en naranja y aquellas que están reguladas a la baja en el WT se muestran en azul. Los círculos representan las proteínas más abundantes que son >1% del proteoma (Tabla 2). Los cuadrados rojos indican las proteínas que se analizan en el texto y los diamantes verdes indican los dos transportadores de membrana que probablemente estén involucrados en el transporte de betaína/colina/carnitina/DMSP.

En las muestras IM, se identificaron un total de 1121 proteínas, de las cuales 387 fueron significativamente diferentes entre el mutante WT y olsA (Fig. 3D). El IM está dominado por 24 proteínas que representan >55% del proteoma IM total, 13 de las cuales son significativamente diferentes entre el WT y el mutante (Tabla 2). Esto sugiere que la pérdida de aminolípidos provoca un cambio dramático en el proteoma IM. En las muestras de OM, un total de 188 proteínas se expresaron diferencialmente en el mutante en comparación con el del WT (Fig. 3E). El OM está dominado por 15 proteínas que representan ~80% del proteoma total de OM (Tabla 2), en particular tres porinas de membrana no caracterizadas, una de las cuales (SPO3430) por sí sola representó >30% del proteoma total de OM.

Para comprender mejor el impacto de la deficiencia de aminolípidos en los perfiles de proteínas de membrana y los procesos celulares asociados, mapeamos proteínas expresadas diferencialmente tanto de IM como de OM utilizando el mapeador de vías KEGG con clasificaciones de ortología KEGG (KO). Notablemente, de 32 categorías KO identificadas, las proteínas de 2 categorías KO se vieron significativamente afectadas por la deficiencia de aminolípidos, a saber, enzimas metabólicas (KO01000) y transportadores (KO02000) (Tabla S1). En la categoría KO01000, el mutante olsA regulaba negativamente las proteínas necesarias para la síntesis/captación de glutamina y ornitina en respuesta a la falta de aminolípidos que contienen glutamina/ornitina en la membrana. La arginasa (SPO2119) responsable de la producción de ornitina y el transportador ABC de glutamina (SPO3043) están regulados negativamente en el mutante (Figura complementaria S4), lo que sugiere que la biosíntesis de aminolípidos representa un importante drenaje metabólico de nitrógeno en esta bacteria. Esto se ve respaldado además por la sobrerrepresentación de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa (GS-GOGAT, SPO0765-SPO3272) y la proteína PII (SPO0397) en el WT y la glutamato deshidrogenasa (GDH, SPO1743) en el mutante olsA, respectivamente. La proteína PII, junto con el complejo enzimático GS-GOGAT dependiente de ATP, son importantes para la asimilación eficaz de bajas concentraciones de amonio, mientras que la glutamato deshidrogenasa generalmente tiene una menor afinidad por el amonio.

La expresión de un homólogo de la bomba de eflujo de AcrAB (SPO1397-1398) también está significativamente regulada a la baja en el mutante olsA (Fig. 3D, Tabla S2). Por lo tanto, investigamos si esto conduce a un aumento en la susceptibilidad a los antibióticos, dado el papel de esta clase de bombas de eflujo en la exportación de antibióticos y otras moléculas tóxicas de la célula. La susceptibilidad aumentó hacia varios antibióticos de diferentes clases (Figura complementaria S5), lo que sugiere que esta disminución en la resistencia es causada por la disminución en la expresión de la bomba de eflujo debido a la alteración en el perfil lipídico del mutante. Este fenotipo no se produjo con todos los antibióticos probados, dada la actividad de amplio espectro, pero no universal, de las bombas de eflujo AcrAB.

El análisis de la vía KEGG antes mencionado descubrió cambios dramáticos en la abundancia de transportadores de membrana en el mutante con deficiencia de aminolípidos. En la fracción IM, 48 proteínas transportadoras fueron más abundantes en el WT que en el mutante olsA. De hecho, muchas de esas proteínas IM altamente representadas en la cepa WT son transportadores de nutrientes de membrana, por ejemplo, aminoácidos (SPO3706, SPO0823, SPO1849), poliaminas (PotA, PotF, PotG), fósforo orgánico (UgpB) y metales inorgánicos (Mg2+). ) (Tabla complementaria S2). En particular, los datos de proteómica comparativa sugirieron que el metabolismo de la colina estaba potencialmente gravemente afectado en el mutante con dos transportadores de membrana probablemente involucrados en el transporte de aminas cuaternarias significativamente sobrerrepresentados en el WT en comparación con la cepa mutante olsA, es decir, un transportador de soluto orgánico de la cepa mutante. familia de betaína-colina-carnitina (BCCT) (SPO3186) y un transportador tipo ABC de la familia de betaína-colina-carnitina (SPO1131) (Fig. 3D). La colina es un nutriente importante para las roseobacter marinas y la capacidad de utilizar colina como fuente de carbono/nitrógeno está muy extendida en las bacterias del clado roseobacter [16]. La degradación de la colina conduce a la formación de sarcosina y las proteínas involucradas en la oxidación de la sarcosina también están significativamente sobrerrepresentadas en la fracción de la membrana interna WT (Fig. 3D). Esto se ve respaldado aún más por una mayor expresión de MetF, una enzima clave en la vía de oxidación de un carbono de las aminas cuaternarias (Fig. 3D, 14). Por lo tanto, probamos la actividad de transporte de colina en el mutante WT y olsA utilizando 14C-colina en un rango de concentraciones (0,5 a 25 µM). La absorción de colina por WT Ruegeria pomeroyi DSS-3 siguió la cinética de Michaelis-Menten. En medio ½ YTSS, la velocidad máxima para el transporte de colina (Vmax) se redujo significativamente en el mutante olsA (Fig. 4A). Esta deficiencia en el transporte de colina fue aún más pronunciada cuando las células se cultivaron en medio MAMS definido (Fig. 4B, C). Aquí, la Vmax del WT fue ~8 veces mayor que la del mutante olsA (Tabla 3). De manera similar, también probamos la actividad del transportador DMSP del mutante WT y olsA aplicando tres concentraciones diferentes de 14C-DMSP (50, 150 y 300 µM) utilizando cultivos cultivados en medio de caldo marino. La absorción en el mutante olsA se redujo fuertemente en comparación con el WT, siendo aproximadamente 21 veces mayor en el WT con DMSP 50 µM. A 150 y 300 µM, la absorción de DMSP en el WT era todavía ~11 y ~9 veces mayor que en el mutante olsA (Fig. 4D). Nuestros datos sugieren que la incapacidad de producir aminolípidos compromete la actividad del transportador de membrana de nutrientes esenciales como la colina y el DMSP en esta bacteria. En conjunto, la eficiencia reducida de una serie de transportadores de membrana en el mutante olsA debido a la pérdida de aminolípidos QL/OL probablemente explica la falta de competitividad de la cepa mutante contra la WT en el cocultivo (Fig. 2D, E).

Captación de 14C-colina en el tipo salvaje (WT) y mutante olsA en medio A ½ YTSS, medio B MAMS con Pi 2 mM y medio C MAMS con Pi 0,5 mM. D Captación de 14C-DMSP en el mutante WT y olsA en tres concentraciones definidas. Las células se cultivaron en medio caldo marino (MB) para inducir la absorción de DMSP. Los datos presentados son la media de triplicados biológicos, excepto el mutante olsA en medio MAMS con Pi 0,5 mM, donde n = 4. Las barras de error indican la desviación estándar.

Anteriormente hemos demostrado que la remodelación de lípidos de membrana mediada por PlcP impone compensaciones para la supervivencia de Phaeobacter sp. MED193 [29]. Para comprender mejor la importancia ecológica de estos aminolípidos, comparamos la capacidad del fago DSS3-Phi2, el primer bacteriófago conocido que infecta Ruegeria pomeroyi DSS-3 [26], para unirse al mutante WT y olsA. Nuestra hipótesis es que los aminolípidos podrían interactuar con componentes de la superficie celular que podrían estar involucrados en el proceso de unión de los fagos y, por lo tanto, la mutación de olsA podría afectar la adsorción de los fagos. Realizamos un ensayo de unión de fagos en el WT, el mutante olsA y un control de solo medio, midiendo la adsorción de fagos durante un período de 30 minutos (Fig. 5A). De hecho, nuestros datos revelaron que este fago es menos capaz de unirse al mutante olsA que el WT, siendo la constante de adsorción aproximadamente 4 veces menor para el mutante (Fig. 5B).

Una cinética de unión del fago DSS3-Phi2 a WT (diamantes azules), un mutante olsA (cuadrados naranjas) y un control de solo medio (triángulos negros). B Constante de adsorción. Los datos presentados son la media de triplicados biológicos. Las barras de error indican la desviación estándar. Las células se cultivaron en medio ½ YTSS. *p < 0,01, prueba t.

Hemos demostrado que los aminolípidos QL y OL se encuentran tanto en la IM como en la OM de esta bacteria diderm Gram-negativa. Nuestros resultados corroboran estudios en Paracoccus denitrificans que también mostraron que los OL se encuentran en el OM [30]. La MO de las bacterias Gram-negativas representa una barrera física importante para que las bacterias se comuniquen con el entorno circundante. Nuestro análisis proteómico mostró que la OM de Ruegeria pomeroyi DSS-3 estaba dominada por una única porina OM (SPO3430), que representó ~49% del proteoma total de OM en el WT y ~34% en el mutante olsA, aunque esta diferencia fue no estadísticamente significativo (Tabla 2). Las porinas de membrana en bacterias marinas del clado Roseobacter en general están poco estudiadas [31, 32]. En Roseobacter denitrificans, se estima que las porinas homotrímeras formadoras de poros cubren hasta ~70% de la superficie de la MO. Además, estos tipos de porinas son selectivas para cationes, aunque aún no se han establecido los solutos exactos que transportan [31].

Nuestros análisis de lipidómica mostraron que los aminolípidos OL y QL son lípidos principales en la membrana de esta bacteria y que la pérdida de estos lípidos se compensa principalmente con el fosfolípido PG. Parece que la producción de aminolípidos en la cepa WT representa un drenaje importante para el flujo de nitrógeno. La proteómica comparativa mostró que la cepa WT sobreprodujo significativamente transportadores para especies de nitrógeno orgánico y se activó la vía de asimilación de amonio de alta afinidad que involucra la glutamina sintetasa (GS) y la glutamato sintasa (GOGAT). Las enzimas responsables de la formación de ornitina a partir de arginina también estaban reguladas positivamente. Por el contrario, en el mutante olsA, la vía GS-GOGAT de alta afinidad estaba regulada negativamente y se prefirió la vía de la glutamato deshidrogenasa de baja afinidad. Tal transición en la vía de asimilación de amonio sugiere fuertemente que la cepa WT tiene una mayor demanda de nitrógeno para sintetizar suficientes aminolípidos para incorporarlos en la membrana, mientras se beneficia de una menor demanda de fósforo. Nuestro hallazgo tiene implicaciones importantes para comprender mejor la ecofisiología de estas bacterias marinas cosmopolitas, lo que sugiere que han optimizado su demanda celular en respuesta a la escasez de fósforo en la superficie del océano. En este sentido, cabe señalar que muchas roseobacterias marinas también son capaces de remodelar los lípidos de membrana reemplazando los fosfolípidos con glicolípidos libres de fósforo que contienen azúcar [3].

En R. pomeroyi, detectamos 1121 proteínas asociadas con la MI. El número de proteínas IM detectadas en R. pomeroyi está en consonancia con el número de proteínas IM en E. coli y, de hecho, los tamaños de los cromosomas son comparables (4,6 Mbp frente a 4,1 Mbp). Se predice que E. coli tiene ~1000 proteínas IM integrales, ~570 asociadas periféricamente con lipoproteínas IM y 24 IM [33]. La abolición de la biosíntesis de aminolípidos en el mutante olsA provocó un cambio dramático en la composición de las proteínas de la membrana, con la abundancia de ~35% de las proteínas (387 de 1121 detectadas) asociadas con la IM de R. pomeroyi DSS-3 cambiando significativamente, destacando que Las interacciones proteína-lípido desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la función "óptima" de la membrana en esta bacteria. Al investigar los cambios en el proteoma IM entre el mutante WT y olsA, llama la atención que ~60 proteínas transportadoras de membrana están reguladas diferencialmente por estos aminolípidos. Utilizando sustratos marcados con 14C, pudimos validar los resultados predichos a partir de la proteómica comparativa, lo que muestra directamente que la absorción tanto de 14C-colina como de 14C-DMSP se ve obstaculizada por la falta de aminolípidos en la membrana. Probablemente esto se deba al hecho de que los transportadores de membrana requieren lípidos específicos para mantener una confirmación favorable para el transporte eficiente de solutos. Trabajos anteriores en Escherichia coli han demostrado que el transportador de membrana para la betaína, BetP, requiere interacciones específicas con el lípido aniónico PG para mantener un homotrímero funcional [34]. Una interacción tan específica entre las proteínas de la membrana y los lípidos de la membrana probablemente afecta la aptitud de la bacteria en términos de capacidad de adquisición de nutrientes y puede ayudar a explicar la competitividad de la cepa WT sobre el mutante deficiente en aminolípidos (olsA). Sin embargo, se requiere una caracterización estructura-función más detallada de las interacciones de las proteínas de membrana con estos aminolípidos para obtener una comprensión mecanicista precisa de este proceso, lo que a su vez conducirá a una mejor comprensión de las compensaciones ecofisiológicas que hemos observado aquí. De manera similar, pudimos validar la predicción de que la reducción de la bomba de eflujo de AcrAB (SPO1397-1398) en ausencia de aminolípidos conducía a un aumento de la sensibilidad a varios antibióticos.

La falta de aminolípidos en el mutante olsA también resultó en un aumento significativo en la abundancia de varias proteínas involucradas en el ensamblaje de los componentes de OM, incluidas las proteínas del barril β de OM (complejo BAM), los transportadores de lipopolisacáridos (LPS) y varias porinas de OM. En particular, el complejo BAM y las proteínas transportadoras de LPS se sobreproducen significativamente en el mutante olsA (Tabla 2, Tabla complementaria S2, S3). Los análisis de lipidómica sugieren que la bacteria compensa la pérdida de aminolípidos en la MO aumentando la formación de PG. Es posible que dicha sustitución de aminolípido por PG dé como resultado una incapacidad para mantener la abundancia de las principales porinas OM (SPO3430, desde 48 a 34% en el mutante). Para mantener la integridad de la OM, se sobreproducen otros componentes de la OM (es decir, el complejo BAM, LPS, otras porinas de OM) para compensar la pérdida de esta porina principal de OM (es decir, SPO3430). La necesidad de regular positivamente los componentes de la maquinaria de exportación de proteínas también se refleja en la sobreproducción de SecB (SPO3888) en el mutante. Esta estrategia de rescate de emergencia debido a la pérdida de aminolípidos que causa el trauma de OM también se refleja en la producción de proteínas de respuesta al estrés de OM en el mutante olsA (Tabla complementaria S3), chaperonas moleculares para la secreción y maduración de OM dependiente de Sec (p. ej., DegP ( SPO1625), SurA (SPO2456)) y una proteinasa inducida por estrés HslU (SPO3882) [35,36,37]. Estos hallazgos corroboran con los ensayos de actividad del transportador y los ensayos de competencia entre el mutante WT y olsA, lo que sugiere que aunque la pérdida de aminolípidos puede compensarse mediante una representación excesiva de PG hasta cierto punto, dicha sustitución de aminolípido por PG está lejos de ser posible. óptimo para la bacteria, reduciendo su competitividad.

Los aminolípidos también parecen desempeñar un papel en la capacidad del fago DSS3-Phi2 para unirse a su huésped. Nuestro ensayo de unión de fagos mostró que cuando hay aminolípidos presentes, la tasa de unión de fagos es aproximadamente 4 veces mayor que en el mutante olsA, lo que indica un mayor riesgo de lisis de fagos. Esto tiene implicaciones ecológicas, lo que sugiere un equilibrio entre la aptitud bacteriana y la susceptibilidad a la infección por fagos. Un fenómeno similar se demostró previamente en un escenario de pastoreo de bacterias y protistas. Las bacterias que se someten a una remodelación lipídica mediada por PlcP en respuesta a niveles bajos de fósforo tenían menos probabilidades de ser capturadas por los herbívoros, pero se volvieron más susceptibles a la digestión una vez capturadas [29]. De manera similar, parece que la formación de aminolípidos, que es independiente de la vía de remodelación de lípidos mediada por PlcP, confiere una ventaja competitiva en forma de absorción de nutrientes, pero ejerce compensaciones al hacer que la célula sea más propensa a la infección por bacteriófagos. Aunque aún no se ha identificado el receptor del fago para el bacteriófago DSS3Phi2, es tentador especular que estos aminolípidos pueden ser fundamentales para mantener la abundancia y/o la confirmación correcta de los receptores del fago en la superficie celular de la bacteria. Esto ciertamente merece una mayor investigación. El papel de estos aminolípidos en las interacciones con los protistas herbívoros es menos claro ya que el mutante olsA y el WT Ruegeria pomeroyi se comportan de manera indistinguible cuando se enfrentan al ciliado Uronema marinum (datos no mostrados). Por lo tanto, parece que la bacteria debe ajustar la producción de aminolípidos para equilibrar la capacidad de absorción de nutrientes y la lisis por los fagos.

En conjunto, nuestros resultados demuestran que los aminolípidos desempeñan un papel integral en la ecofisiología de una bacteria marina cosmopolita. Dado que los lípidos de ornitina y glutamina son omnipresentes en las bacterias marinas del clado roseobacter, es probable que MRC haya ajustado su composición de lípidos de membrana para mantener su competitividad en los ecosistemas microbianos marinos.

Todos los datos están incluidos en el manuscrito. Cepas bacterianas, mutantes y fagos están disponibles previa solicitud.

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Descargar referencias

Este proyecto recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención nº 726116). También agradecemos la financiación del Consejo de Investigación del Medio Ambiente Natural (NE/M002233/1). Agradecemos al Dr. Yuanchao Zhan por proporcionar el fago DSS3Phi2 para este trabajo y al Dr. Andy Millard y al Dr. Richard Puxty por muchas discusiones inspiradoras sobre bacteriófagos.

Estos autores contribuyeron igualmente: Rachel Stirrup, Michaela A Mausz.

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Warwick, Coventry, CV4 7AL, Reino Unido

Rachel Stirrup, Michaela A. Mausz, Eleonora Silvano, Andrew Murphy, Richard Guillonneau, Moses Quareshy, Branko Rihtman, Maria Eagle Ferretjans, David J. Scanlan y Yin Chen

Escuela de Ingeniería y Ciencias Ambientales, Universidad Zhejiang Gongshang, Hangzhou, 310012, China

Ruo He

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de East Anglia, Norwich Research Park, Norwich, NR4 7TJ, Reino Unido

Jonathan D.Todd

Instituto de Tecnología Marina y Ambiental, Centro de Ciencias Ambientales de la Universidad de Maryland, 701 E. Pratt Street, Baltimore, MD, 21202, EE. UU.

Feng Chen

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YC concibió el estudio. RS, MAM, AM, MA-F y RH realizaron la investigación y analizaron los datos con la ayuda de todos los coautores. RS, MAM, DJS e YC escribieron el manuscrito con la ayuda de todos los coautores. Todos los autores contribuyeron a la revisión y edición.

Correspondencia a Yin Chen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Clasificación: Enfoques integrados de genómica y posgenómica en ecología microbiana.

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Reimpresiones y permisos

Estribo, R., Mausz, MA, Silvano, E. et al. Los aminolípidos provocan compensaciones funcionales entre la competitividad y la unión de bacteriófagos en Ruegeria pomeroyi. ISME J 17, 315–325 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01346-0

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Recibido: 09 de julio de 2022

Revisado: 17 de noviembre de 2022

Aceptado: 21 de noviembre de 2022

Publicado: 07 de diciembre de 2022

Fecha de emisión: marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01346-0

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